Disciplina: Elementos de Microscopia e Microanálise Docente: Profa Dra. Maria Tercília Vilela de Azeredo Oliveira Alun

1. Pós-Graduação em Genética Técnicas Citoquímicas aplicadas às alterações biológicas em resposta a agressões ambientais Disciplina: Elementos de Microscopia e Microanálise Docente: Profa Dra. Maria Tercília Vilela de Azeredo OliveiraAluna: Maria Isabel Afonso da Silva

2. A ordem Chelonia: • muitas particularidades • características peculiares • Poucas referências bibliográficas M.a. de evolução e adaptações

3. Crescente expansão das fronteiras agrícolas e industriais contaminam os habitats dos animais silvestres intensa exploração e urbanização • Comprometer a sobrevivência e fisiologia dos organismos; • Induzir alterações genéticas Mutações e/ou Carcinogênese. INTRODUÇÃO

4. INTRODUÇÃO Phrynops geoffroanus ou “Cágado-de-Barbelas” Ampla distribuição na América do Sul

5. Perfil fisiológico Perfil hematológico Biologia da espécie Manejo adequado Preservação Hematologia de répteis Características fisiológicas Influências ambientais INTRODUÇÃO

6. O perfil hematológico de répteis pode sofrer grande variação fisiológica; • A interpretação dos achados da série branca é distinta e complexa • É necessário elaborar um perfil para a espécie em estudo em determinada região e situação através de pesquisas periódicas. • Estudos em relação a diversas condições ambientais => hábitos de vida e adaptações ao ambiente, • futura comparação com outras espécies para maior compreensão dos aspectos evolutivos e conhecimento sobre esta.

7. Punção Cardíaca Amostras Sanguíneas

8. 1- Hemograma • Hematócrito • Dosagem da hemoglobina circulante • Contagem de células • Contagem de eritrócitos • Cálculo de leucócitos • Cálculo dos índices hematimétricos • VGM • CHGM • HGM • Contagem diferencial dos leucócitos

9. Panótipo (Hematocor-BiológicaR) Reação de Acidofilia/Basofilia-Mediadas por Ligações Eletrostáticas Basofilia: Corantes básicos (+)/ catiônico Substrato aniônico (-) Como a hematoxilina - grupamentos fosfatos dos ácidos nucléicos (Núcleo) Acidofilia: Corantes ácidos (-)/ aniônico Substrato catiônico (+) Como a eosina Amino de resíduos protéicos (NH3)- (núcleo e Citoplasma) • Coloração de rotina para análise geral da morfologia das células sanguíneas • Facilita a identificação e diferenciação dos leucócitos

10. Células Vermelhas de Quelônios Atuam na inflamação, promovem fagocitose; como célula hemostática

11. Requisitados no combate a doenças infecciosas de origem bacterianas infecção viral, Respondem à infecções bacterianas Células brancas de Quelônios

12. Estão presentes no combate a infecções bacterianas. • Encontrados em infecções parasitárias. • reações imunes. Células Brancas de Quelônios

13. Citoquímica de Enzimas • proteínas de forma tridimensional  acelerar as reações químicas  são catalisadores biológicos. • O resultado da reação é uma mudança específica do substrato, criando uma nova molécula química ou um produto.

14. habilidade de catalisar, em condições ácidas, a hidrólise de monoesteres ortofosfato Podem ser diferenciadas de acordo com propriedades estruturais, catalíticas, imunológicas, distribuição no tecido e localização subcelular Copyright ©2002 BMJ Publishing Group Ltd. • As enzimas são classificadas de acordo com o tipo de reação química que realizam.

15. Fosfatases ácidas • Encontradas em eritrócitos, leucócitos, fígado, baço, rins, ossos e outros tecidos em humanos • Em répteis não se tem muito estudo sobre sua localização. • A LAP => monoester ortofosfórico do compartimento endossomo/lisossomo fundamental para o catabolismo de um ou vários substratos no lisossomo. • Muitas doenças lisossomais => manifestações morfológicas, bioquímicas e clínicas causadas pelo armazenamento do conteúdo lisossômico.

16. hidrolizam uma variedade de ésteres orgânicos com a liberação de íons fosfatos. Seu papel é muito importante na autólise de tecidos Fosfatases ácidas • Responsáveis pela hidrólise dos fosfatos de ésteres orgânicos, que durante a incubação cria a base para as reações citoquímicas. • Especificidade por substrato menos limitada • Ótima atividade em valores baixos de pH. • Localização: • Lisossomos, • complexo de Golgi, • corpos multivesiculares • superfície do RER

17. 37ºC por 30’ enzimas liberam o fosfato do substrato -glicerofosfato de sódio + Nitrato de Chumbo (com tampão acetato). precipitado insolúvel de fosfato de chumbo lavar em Tampão Acetato (pH 5,0) e mergulhar em sulfeto de amônia 1%, 1’ • sulfeto de chumbo • depósito granular denso e escuro, com coloração marrom. Fosfatases ácidas Método de fosfato de chumbo - Gömöri (1950) • Como controle, é utilizado meio de incubação sem o substrato • Observações: • O meio de incubação é preparado no dia anterior e permanece over-night a 37º C; • os reagentes são guardados em solução estoque a 4ºC. • O pH da solução de incubação final é importante e não pode exceder 5,2. • A solução de sulfeto de amônia a 1% é preparada no momento de uso.

18. relacionada com a destruição da matriz óssea pela ação de enzimas, com a reabsorção de tecido ósseo.

19. Peroxidases doador POD: fazem parte do grupo das enzimas oxidases. catalisar a transferência H peróxido de hidrogênio peroxidases peróxido de hidrogênio decomposto pela oxidação de cosubstratos (compostos fenólicos e/ou antioxidantes) • Variações nos padrões dos sistemas isoenzimáticos da peroxidase => organismos submetidas a estresses abióticos. • O incremento da atividade dessas enzimas antioxidantes é fundamental para evitar danos em nível celular. • Organismos com altos níveis de antioxidantes => mais tolerantes a danos oxidativos

20. oxida Peroxidases:catalítico para H2O2 benzidina (incolor e insolúvel) azul de benzidina (instável e insolúvel) benzopurpurina (cor marrom avermelhado) Peroxidases É incapaz de funcionar anaerobicamente e precisam de peróxido como catalizador. Método=> Sato (1928), segundo Lison (1960).

21. Peroxidases 1) Solução: sulfato de cobre e ácido acético durante 1’. 2)Lavar com água destilada. 3)Cobrir com uma solução saturada de benzidina + H2O2 (10 V) –homogeneizar- 2 a 8 minutos. Como controle da reação=> dois meios, um na ausência de benzidina e outro sem peróxido de hidrogênio. 4)Lavar novamente e cobrir com solução aquosa de fucsina básica a 1% durante 20 segundos. O material, após novamente ser lavado em água destilada, é seco ao ar e montado em gelatina-glicerina

22. Método citoquímico de peroxidase em amostras de sangue humano. À esquerda- atividade de peroxidase positiva em neutrófilo. A amostra à direita corresponde ao controle da reação.

23. Os métodos + comumente usados para avaliar genotoxicidade e danos citotóxicos => contagem de MN e fragmentação de DNA - detectados em diferentes tipos de células pelo ensaio cometa • Mutagênicos: • agem sobre o desenvolvimento=> redução no índice mitótico => comprometimento no desenv. e cresc. do organismo. • impacto significativo sobre o “pool” gênico de uma população • Alterações citogenéticas específicas x teratogênese • Genotóxicos: • defeitos hereditários -mutações em células germinativas • efeitos teratogênicos • mutações pontuais, deleções, translocações e aneuploidia; • quebra da dupla fita de DNA, • aberrações cromossômicas, • formação de micronúcleo, • intercâmbio de cromátides irmãs.

24. Os micronúcleos: • fragmentos cromossômicos acêntricos • originam-se de cromossomos com atraso durante a anáfase • dispersos no citoplasma – separados do núcleo principal. • Aparência: • pequeno núcleo • MO: material nuclear, intensidade luminosa ~ núcleo, • formato oval/circular • A< 1/3 do núcleo

25. formados durante a telófase • representam a perda de cromatina cromossômico estrutural dano no aparelho mitótico Os micronúcleos:

26. Teste do micronúcleo: • desenvolvido por Schmid (1975) • avaliar genotoxicidade e danos citotóxicos. • detecta mutações brutas: aberrações cromossômicas • Utilizações: • monitoramento biológico e ambiental • rastreio de compostos para determinar a sua genotoxicidade após exposição direta ou indireta • avaliações toxicológicas dos produtos químicos industriais • avaliações dos perigos de exposição geral.

27. Teste do micronúcleo: Esfregaços: • 1. Fixar 10’ em metanol absoluto • 2. Após 24 horas=> em HCl à 60O C por 11’ • 3. Reativo de Schiff por 2 horas, em local escuro. • 4. “Fast Green” por 20 segundos.

29. Teste do micronúcleo: • Vantagens: • acessível, não-invasivo • análise rápida de um elevado número de células • a velocidade e facilidade de análise, • não-exigência de células em metáfase, • pequenas concentrações de células • eficácia em danos clastogênicos e aneugênicos.

30. Ensaio Cometa Outra técnica útil para biomonitoramento de contaminação ambiental. • Processo rápido, simples e sensível => vários tipos de células • Possibilidade de medir a integridade do DNA em nível celular. • Pode detectar baixos níveis de danos de DNA • Exige um pequeno número de células por amostra, • Flexível • Curto período de tempo necessário para concluir um estudo

31. produzem aumento da migração de fragmentos de DNA do núcleo Células com danos no DNA Agentes endógenos/ produtos do metabolismo celular aeróbio e inflamação + exógenos/ uma variedade de agentes químicos e físicos "cauda de cometa". modificar o DNA celular e outros componentes celulares. Ensaio Cometa • A visualização de mobilidade dos fragmentos de DNA => modo conveniente e sensível de detectar quebra de DNA nas células. • O nível de base de danos no DNA varia => espécie x tipo de células; isto influenciará a sensibilidade do ensaio

32. Singh et al. (1988) e Klaude et al. (1996) Ostling e Johanson em 1984 sangue coletado é diluído em solução fisiológica Depositar 10 L da suspensão celular preparada com 120 L de agarose de baixo ponto de fusão a 37º C sobre lâminas pré-gelatinizadas. 20’ em geladeira cobertas com lamínulas. tampão NaOH com EDTA (pH ~13), por 20 minutos em corrente de eletroforese, no escuro solução de lise - 1h neutralizadas com Tris, por 15 minutos e fixadas em etanol absoluto por 10 minutos.

33. A análise => microscópio de fluorescência, em objetiva de 40x.

35. Técnicas de micronúcleo, cometa Ferramentas de biomonitoração das regiões naturais Avaliação de agentes genotóxicos e mutagênicos como um organismo sentinela de efeitos genotóxicos. Phrynops geoffroanus CONCLUSÃO Há grande impacto dos poluentes do ambiente sobre o organismo em estudo. Os dados úteis para futuros estudos que envolvam a biomonitorização das regiões naturais

36. OBRIGADA!!!