Biotecnologia Aplicada ao DNA

1. Biotecnologia Aplicada ao DNA Prof. Rafael Marques

2. sumário

3. Organismos geneticamente modificados (OGM) • SELEÇÃO ARTIFICIAL -VS- TRANSGENIA SELEÇÃO DE ORGANISMOS CONTENDO CARACTERÍSTICAS DE INTERESSE SELEÇÃO DE GENES ESPECÍFICOS DE INTERESSE OGM SURGEM A PARTIR DA INTENÇÃO DO MANIPULADOR OGM SURGEM ALEATORIAMENTE COM O SURGMINETO DE DETERMINADAS MUTAÇÕES POUCO EFICIENTE; PODE LEVAR MUITO TEMPO PARA ACONTECER E COM POSSIBILIDADES LIMITADAS MAIS EFICIENTE; PODE-SE SELEIONAR VÁRIAS CARACTERÍSTICAS, INCLUSIVE DE DIFERENTES ESPÉCIES

4. COMO OCORRE A TRANSGENIA? TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE • Origem das enzimas de restrição • Mecanismo de defesa de algumas bactérias contra bacteriófagos • EcoRI -> G/AATTC • Identificação do GENE DE INTERESSE • Geralmente, a partir do RNAm • Clivagem do GENE DE INTERESSE por enzimas de restrição • Clivagem em sítios específicos • Clonagem do gene por PCR • Vetor do gene • Vírus, ou plasmídeos • Utilização da DNA-ligase para unir dois fragmentos.

6. Utilização do plasmídeo como vetor • Pantoeaagglomerans • Bactérias geneticamente modificadas contra a MALÁRIA! • Alteração dos genes e a produção de toxinas contra o Plasmodium sp.

7. Alimentos transgênicos • Inserção no embrião do vegetal • Agrobacteriumtumefaciens • Genes produtores de anticorpos específicos ou toxinas contra parasitas • Genes que tornam a planta resistentes a agrotóxicos • CUIDADO! • A REDUÇÃO DO CUSTO NÃO SIGNIFICA A ERRADICAÇÃO DA FOME • MÁ DISTRIBUIÇÂO DE ALIMENTOS É O GRANDE PROBLEMA DA FOME

9. Leitura complementar • Todos os consumidores têm o direito de saber o conteúdo do produto que está consumindo e as consequências disso, incluindo as técnicas empregadas para a melhoria daquele alimento. Neste sentido, em 2003, foi publicado o decreto de rotulagem (Decreto 4680/03), obrigando empresas da área da alimentação, produtores e vendedores, a identificarem, com um “T” preto, sobre um triangulo amarelo, o alimento com mais de 1% de matéria-prima transgênica. • No Brasil, onde 9,60% (dados de 2009/2010) das lavouras empregam transgênicos, as pesquisas sobre e o desenvolvimento tecnológico de alimentos transgêncios (ou OGM, organismos geneticamente modificados) são conduzidos pela Embrapa. A partir da Lei de Biossegurança (Lei 11105/05), a responsabilidade pela autorização do plantio e comercialização deste tipo de alimentos é feita pela Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio).

10. teste O milho transgênico é produzido a partir da manipulação do milho original, com a transferência, para este, de um gene de interesse retirado de outro organismo de espécie diferente. A característica de interesse será manifestada em decorrênciaA) do incremento do DNA a partir da duplicação do gene transferido.B) da transcrição do RNA transportador a partir do gene transferido.C) da expressão de proteínas sintetizadas a partir do DNA não hibridizado.D) da síntese de carboidratos a partir da ativação do DNA do milho original.E) da tradução do RNA mensageiro sintetizado a partir do DNA recombinante.

11. Testando... Estão corretas: a) I e II, somente. b) I e III, somente. c) II e III, somente. d) I, II e III, somente. e) I, II, III e IV. • (PUCCAMP-SP) Os avanços biotecnológicos fazem-se notar, sobretudo no setor agrícola. A cada ano são anunciados os resultados de novos experimentos, tais como manipulação genética para obtenção e criação de novas linhagens de plantas, levando a um grande aumento na produção de alimentos. Todavia, o problema da fome persiste no mundo. Por quê? • Em uma discussão sobre o assunto surgiram as seguintes respostas: • I. Não há igualdade de distribuição de alimentos entre os países e dentro de um mesmo país. • II. Em muitas regiões, o aumento da população sobrepuja o aumento na produção de alimento. • III. Pragas atacam e apodrecem alimentos armazenados, impedindo que sejam distribuídos à populações carentes. • IV. A má distribuição de renda deixa boa parte da população humana impossibilitada de comprar alimento.

12. Utilização do vírus como vetor • Aumento da afinidade entre vírus e células cancerosas • Inclusão um gene que produz o fator GM-CSF, responsável por estimular a imunidade natural do organismo humano ao câncer

14. Transgênicos e os danos ambientais • a) o desenvolvimento biológico indesejado de algumas espécies, e o posterior alastramento de seus efeitos lesivos, tanto in natura quanto processados (como a hipótese do alastramento de doenças infecto-contagiosas); • b) o aumento do uso de herbicidas e agrotóxicos, e o aparecimento de pragas mais resistentes, chamadas de superpragas; • c) o aparecimento de traços patógenos em humanos, animais ou vegetais como alergias e o aumento da resistência aos antibióticos; • d) a contaminação genética, com o cruzamento dos OGMs com a biodiversidade natural; • e) a diminuição da biodiversidade • f) a perda de variação genética”. (SUZUKI, 2006).

15. Testando... 1, 2, 3... • O texto abaixo reproduz parte de uma reportagem do programa “Globo Rural” que abordou uma Norma Federal reguladora do cultivo de milho transgênico e do milho convencional. • “Em cada propriedade, o fiscal federal agropecuário faz o teste na lavoura. A folha é misturada a uma solução que aponta se a proteína da planta é geneticamente modificada. O resultado sai em cinco minutos. [...] • Toda essa tecnologia é usada para ajudar o produtor rural a cumprir uma norma que existe desde 2007, que determina o espaçamento necessário entre a lavoura de milho convencional e a lavoura de milho transgênico do vizinho. • Quando uma lavoura de milho transgênico faz divisa com outra que tem milho convencional o produtor deve respeitar a distância mínima de isolamento de cem metros. Se isso não for possível, o proprietário do milho transgênico deve fazer uma borda com 20 metros onde tenha pelo menos dez linhas de milho convencional. [...]”

16. “Com isso, estaremos garantindo para o agricultor vizinho que, se planta milho convencional, ele possa vender como milho convencional. Se a gente não fizer isso, o vizinho que planta o milho convencional do lado de quem planta milho transgênico, vai ter que vender o milho como transgênico”, explicou o agrônomo Rodrigo Pita.” • Disponível em: http://globoruraltv.globo.com/GRural/0,27062,LTO0-4370-341389,00.html. Acesso em: 8 jul.2010. • Para que o agricultor continue a ter sua plantação classificada como milho convencional, o cumprimento da Norma reduz a possibilidade de • A) contaminação da planta convencional com uma proteína estranha. • B) manutenção da quantidade normal do pólen produzido pelas anteras. • C) deformação nas estruturas das anteras e dos pistilos. • D) contato do pólen da planta transgênica

17. Mais uma... • (PUCCAMP) Obtiveram-se plantas transgênicas com as seguintes características: • I. Tomateiros cujos frutos passam mais tempo amadurecendo no pé, tornando-se mais saborosos. • II. Algodoeiros cujas folhas se tornaram impalatáveis para a herbivoria. • III. Pés de milho cujas sementes produzem hormônios de crescimento humano. • Toda essas plantas são úteis para a espécie humana, entretanto, interferência na composição da diversidade local de insetos ocorre somente com: • a) I. • b) II. • c) III. • d) I e II. • e) I e III.

18. O que são Células-Tronco Embrionárias? Células com pouca ESPECIALIZAÇÃO, encontradas durante o desenvolvimento embrionário, que potencialmente se transformam em outros tipos celulares. Totipotentes Pluripotentes Multipotentes

20. teste • (UNIFESP) Um pesquisador precisa obter células-tronco para iniciar experimentos em terapia gênica. Aponte a alternativa que relaciona o procedimento e a justificativa corretos para que tal pesquisador tenha sucesso. • a) Obter células-tronco de embriões em fase de gástrula em vez de obtê-las da blástula quando ainda não é possível conseguir células tão indiferenciadas. • b) Trabalhar apenas com embriões em vez de organismos adultos, uma vez que em adultos não existem células-tronco. • c) Conseguir células germinativas do ovário de uma fêmea adulta, pois ali, elas estão menos diferenciadas do que as células germinativas nos testículos de um macho adulto. • d) Optar pela obtenção das células do cordão umbilical de recém-nascidos em vez de obtê-las da fase de gástrula, já que no cordão a diferenciação é menor e o número de células maior. • e) Obter células do embrião em fase de blástula quando a indiferenciação é maior, em vez de obtê-las da gástrula ou do cordão umbilical quando as células já estão mais diferenciadas.

21. Aplicação terapêutica das Células-Tronco

24. Terapia gênica – Utilização de vírus da geneterapia • 1. Lembrar que esse processo visa a regressão de doenças de origem genética provocada por alelos recessivos (ex: aa), como a Diabetes Melitus tipo I, Anemia falciforme, Talassemia, Fibrose cística e Distrofia muscular de Duchenne. • 2. Métodos de invasão virão se baseiam na introdução do DNAv (Adenovírus) ou RNAV (Retrovírus ou vírus RNA(+) e RNA(-), ao DNA Celular, o que altera a constituição genética da célula • 3. Dependendo de onde o material genético viral se encaixa, pode-se ter o desenvolvimento de câncer.

25. Clonagem terapêutica • ETAPAS DO PROCEDIMENTO • 1. Extração do núcleo de uma célula SOMÁTICA • 2. ENUCLEAÇÃO de um óvulo • 3. Introdução do núcleo somático ao óvulo • 4. Estimulação elétrica • 5. Retirada dos blastocistos • 6. Indução da diferenciação específica (EPIGENÉTICA) • 7. Reconstrução de tecidos lesionados OBS1: Redução dos níveis de rejeição se o doador do núcleo = receptor OBS2: Em casos de doenças genéticas (Alzheimer, Parkinson...) doador do núcleo receptor

26. Clonagem de indivíduos • Segue a mesma linha de procedimento da CLONAGEM TERAPÊUTICA • OCORRE REIMPLANTE DO ZIGOTO NA FÊMEA E O DESENVOLVIMENTO É COMPLETO • PROBLEMAS: • 1. DNA do doador já envelhecido (telômeros) • 2. Alta especialização celular • 3. Alta taxa de não desenvolvimento, má formações e mortes

27. Cuidado na prova!! • (UNESP) Em julho de2002, a Unesp produziu um clone animal a partir do núcleo de uma célula adulta. Pesquisadores da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, do campus de Jaboticabal, removeram o núcleo de uma célula obtida da cauda de uma vaca da raça Nelore (animal A) e injetaram-no no óvulo anucleado de uma vaca de abatedouro (animal B). Posteriormente, esse “óvulo” foi implantado no útero de uma vaca mestiça holandesa (animal C). Do desenvolvimento desse “óvulo” resultou a bezerra Penta. Nas células da bezerra Penta, há: • a) DNA nuclear do animal A e DNA mitocondrial do animal C. • b) DNA nuclear do animal A e DNA mitocondrial do animal A. • c) DNA nuclear do animal A e DNA mitocondrial do animal B. • d) DNA nuclear do animal B e DNA mitocondrial do animal C. • e) DNA nuclear do animal C e DNA mitocondrial do animal A.

28. Eletroforese e a indentificação do dna • Corrimento em GEL DE AGAROSE, fragmentos de DNA, que migram do POLO NEGATIVO ao POLO POSITIVO • Lembre-se!! • O Fosfato do DNA possui carga negativa!!

29. Analisando os resultados por dna nuclear

30. Análise por dna mitocondrial • DNA MITOCONDRIAL É SEMPRE MATERNO!! • Comparação do DNA no indivíduo com o DNA da mãe ou da avó materna!

31. Questão • A estratégia de obtenção de plantas transgênicas pela inserção de transgenes em cloroplastos, em substituição à metodologia clássica de inserção do transgene no núcleo da célula hospedeira, resultou no aumento quantitativo da produção de proteínas recombinantes com diversas finalidades biotecnológicas. O mesmo tipo de estratégia poderia ser utilizada para produzir proteínas recombinantes em células de organismos eucarióticos não fotossintetizantes, como as leveduras, que são usadas para a produção comercial de várias proteínas recombinantes e que podem ser cultivadas em grandes fermentadores.  • Considerando a estratégia metodológica descrita, qual organela celular poderia ser utilizada para inserção de transgenes em leveduras? • A) LisossomoB) MitocôndriaC) PeroxissomoD) Complexo golgienseE) Retículo endoplasmático

32. Teste • Para a identificação de um rapaz vítima de acidente, fragmentos de tecidos foram retirados e submetidos à extração de DNA nuclear, para comparação com o DNA disponível dos possíveis familiares (pai, avô materno, avó materna, filho e filha). Como o teste com o DNA nuclear não foi conclusivo, os peritos optaram por usar também DNA mitocondrial, para dirimir dúvidas. • Para identificar o corpo, os peritos devem verificar se há homologia entre o DNA mitocondrial do rapaz e o DNA mitocondrial do(a) • A) paiB) filhoC) filhaD) avó maternaE) avô materno

33. Testando...

34. Projeto genoma humano • Permitiu a identificação dos genes que causam ou contribuem para doenças genéticas ou para o câncer. • Ajudou o aconselhamento genético • Descobriu mais sobre o funcionamento dos genes • Ajudou a descobrir a sequência de aminoácidos de várias proteínas • Criação de drogas específicas para cada tipo de doença • Análise do grau de parentesco evolutivo entre as espécies

35. Penúltima... • (UNIFOR) Ultimamente tem sido anunciados uma série de “Projetos Genoma”, com o objetivo de sequenciar o genoma de espécies de importância econômica, como o eucalipto e o café. Sequenciar o genoma de um organismo significa descobrir: • a) O seu código genético. • b) A sequência de bases do seu DNA. • c) As relações de parentesco do organismo. • d) Os genes importantes na produtividade. • e) Os seus genes de resistência a pragas e doenças.

36. The lastone • (UFPI) O Projeto genoma humano tem como objetivo determinar a sequência de bases de todos os genes de nossa espécie. Isto pode ser feito graças ao instrumental bioquímico da engenharia genética disponível nos dias de hoje, como as enzimas bacterianas, conhecidas como enzimas de restrição. Assinale a alternativa que apresenta, corretamente, a forma de atuação dessas enzimas. • a) As enzimas de restrição cortam o DNA apenas nos locais onde existem certas sequências de bases nitrogenadas. • b) As enzimas de restrição cortam o DNA nos locais onde reconhecem o açúcar desoxirribose. • c) A utilização das enzimas de restrição permite separar moléculas de DNA de acordo com seu tamanho e carga elétrica. • d) A utilização de enzimas de restrição permite cortar o DNA nos locais onde reconhecem o ácido fosfórico. • e) As enzimas de restrição quebram o DNA, separando-o sempre em nucleotídeos individuais.