Purificação de Produtos Biotecnológicos

1. ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA EEL / USP Purificação de Produtos Biotecnológicos Disciplina: Engenharia Bioquímica II A Programa de Aperfeiçoamento de Ensino (PAE): Livia Carneiro Profº Arnaldo Márcio

2. Etapas de um Processo de Purificação

4. Rompimento Celular • Produtos intracelulares tornam o processo de purificação de biomoléculas mais difícil em comparação com produtos extracelulares devido à necessidade do rompimento • Produtos Intracelulares

5. Aplicados após a separação e lavagem das células; • Células animais (possuem apenas membrana), fácil rompimento com baixa força de cisalhamento; • Ex.: Células animais: rompidas por simples variação da pressão osmótica do meio, adição de detergentes ou aplicação de ultra-som de baixa intensidade

6. Forma mais adequada de Rompimento? • Tipo de microrganismo • Tamanho da célula; • Tolerância a tensões de cisalhamento; • Necessidade de controle de temperatura; • Gasto de energia;

7. Parede Celular

8. Métodos de Rompimento Celular • Enzimáticos • Lize enzimática

9. Homogeneizador a alta pressão Cavitação Turbulência Cisalhamento

10. Mecânico - Homogeneizador a alta pressão • Este tipo de rompimento provoca aumento da temperatura do meio, por isso necessita de sistema de refrigeração • Pressões utilizadas podem variar de 5000 a 20000 psi, velocidades de alimentação da ordem de 180 a 280 m/s e concentrações celulares de 450 a 750 g/L (massa úmida).

11. Mecânico - Homogeneizador a alta pressão O desempenho pode ser afetado por: • Pressão de operação; • Velocidade de alimentação; • Temperatura; • Estado fisiológico do microrganismo; • Condições de cultivo; • Tipo de célula e sua concentração. • tamanho das células (maior => rompimento mais fácil) • pressão (maior => maior eficiência) • número de passagens (múltiplas etapas aumenta o ren-dimento)

12. Existe um modelo matemático para avaliar o rompimento, que neste caso é de 1a ordem em relação ao número de passagens e de potência em relação à pressão de trabalho:

13. logRm   =    k . N . Pa (Rm – R) onde: Rm é a concentração máxima de proteína disponível para ser liberada (g/L) R é a concentração de proteina liberada (g/L) k é a constante de velocidade que depende de T, X e do tipo de célula N é o número de passagens P é a pressão a é constante que depende do tipo de microrganismo e das condições de crescimento (varia de 0,86 a 2,9) (tabela)

14. Mecânico – Moinho de Bolas • Consiste na passagem da suspensão celular por uma câmara de trituração (vertical ou horizontal) provida de um eixo com discos de agitação e preenchida com esferas de vidro. • O rompimento ocorre devido à força de cisalhamento aplicada pelas esferas de vidro contra a parede celular das células.

15. Mecânico – Moinho de Bolas

16. Mecânico – Ultra-som • O rompimento ocorre quando ondas sonoras (~20kHz), são convertidas em vibrações em um meio líquido e causam o fenômeno de cavitação. • Escala de laboratório.

17. Mecânico - Ultrassom

18. Rompimentos Mecânicos • Desvantagens: • As elevadas forças de cisalhamento provocadas pelos rompimentos mecânicos podem destruir organelas celulares e desnaturar enzimas; • Com o rompimento integral das células todo o conteúdo intracelular, incluindo ácidos nucléicos, organelas e fragmentos celulares é liberado junto com a molécula-alvo, sendo que o homogeneizado celular pode conter grande quantidade de contaminantes e elevada viscosidade.