CHIMICA ANALITICA

1. BIOCHIMICA FARMACOLOGIA CHIMICA E TECNICA FARMACEUTICA CHIMICA ANALITICA FISIOLOGIA CHIMICA GENERALE, ORGANICA, FISICA MICROBIOLOGIA

2. Tempo di analisi mmol ore nmol pmol fmol amol zmol ymol min 1970 2000 1970 2000 1970 2000 METODOLOGIE CHIMICO-ANALITICHE Limite di rivelazione Variabilità analitica (CV%) 20 >5

3. Massa 106 105 Quantità relativa del campione 104 103 102 1960 1970 1980 1990 2000 Anni

4. Implicazioni socio-economiche Normative di legge Microinquinanti ambientali Analisi forense Referto analitico DECISIONE Analisi di alimenti e merceologiche Analisi farmaceutica Analisi chimico-tossicologiche Beni culturali Analisi chimico-cliniche

5. ANALISI QUALITATIVA: identificazione delle specie presenti nel campione ANALISI QUANTITATIVA: processo con cui si stabilisce in termini numerici la quantità dei compenenti presenti nella matrice ANALITA: è la specie o sostanza chimica che deve essere identificata o misurata (es. Principio attivo in una formula farmaceutica, clorofilla in una folgia, ecc). MATRICE: mezzo contenete l’analita INTERFERENTI: spcie che provocano un errore accrescendo o attenuando la quantità che si sta misurando

6. DEFINIZIONE DEL PROBLEMA ANALITICO • Il problema analitico deve essere in primo luogo discusso con il “cliente” e deve essere raggiunto un accordo per soddisfare le sue esigenze. A questo scopo, vanno definiti: • la natura del campione • l’uso dei risultati analitici • le specie da analizzare • le informazioni richieste, tra le quali • -informazioni qualitative, complete o limitate ad alcuni componenti • -informazioni quantitative, incluse la precisione e l’accuratezza idonee e i limiti di rivelazione • -tempi e costi dell’analisi

7. SCELTA DEL METODO ANALITICO Le misure analitiche devono essere eseguite utilizzando metodi e strumentazioni che sono state validate allo scopo di garantirne l’idoneità rispetto alle specifiche concordate col “cliente”.

8. 4.0 3.5 3.0 2.5 mg/Kg 2.0 1.5 1.0 0.5 0 Cause di discrepanza: - inadeguati metodi di estrazione - uso di metodi analitici non appropriati per i livelli di concentrazione dell’analita ANALISI DEL PIOMBO IN UNO STESSO CAMPIONE DI CAVOLO LIOFILIZZATO EFFETTUATA DA 27 LABORATORI DI DICHIARATA COMPETENZA Limiti di accettabilità: 0.23-0.41 1 1 1 1 2 2 2 2 1 1 3 3 1 1 2 2 2 2 1 1 2 2 1 1 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 n. laboratori

9. GENERALITA’ Materiale grezzo da analizzare . La procedura analitica può essere suddivisa nelle seguenti fasi: Campionamento – è lo stadio che, a partire dal materiale grezzo, porta ad un campione di dimensioni adatte per l’analisi Preparazione del campione – è lo stadio che converte il campione in una forma adatta all’analisi, in dipendenza della tecnica analitica selezionata Analisi – in questo stadio viene effettivamente determinata la quantità di analita contenuta nel campione Campionamento Preparazione del campione Preparazione degli standard Analisi Risultato finale

10. CAMPIONAMENTO L’obiettivo principale del campionamento è quello di ottenere un campione omogeneo e rappresentativo. Quantità del materiale da analizzare Stato fisico del materiale da analizzare (solido, liquido, gassoso) Composizione chimica del materiale da analizzare (la procedura di campionamento non deve distruggere od alterare l’analita contenuto nel campione)

11. CAMPIONAMENTO: MATERIALI SOLIDI ETEROGENEI A parte piccoli volumi di campioni liquidi o gassosi, tutti i materiali oggetto di un’analisi chimica andrebbero considerati come eterogenei. La situazione limite può essere, ad esempio, quella di un carico di minerale grezzo, costituito da frammenti e pezzi eterogenei delle più svariate dimensioni. Esistono procedure ben precise per campionare materiali eterogenei in modo da ottenere campioni rappresentativi.

12. CAMPIONAMENTO: LIQUIDI E SOSTANZE GASSOSE Le specie gassose che si vogliono analizzare vengono concentrate in piccoli volumi mediante una delle seguenti procedure: Condensazione allo stato liquido (ad esempio mediante raffreddamento) Intrappolamento in una soluzione mediante una opportuna reazione chimica (es. CO2(g) + NaOH  Na2CO3) Adsorbimento sulla superficie di adeguati materiali solidi Queste procedure (in particolare le ultime due) permettono anche di attuare una preconcentrazione dell’analita direttamente durante la fase di campionamento.

13. CAMPIONAMENTO: INTEGRITA’ DEL CAMPIONE Il campione (e in particolare l’analita) non dovrebbero subire alterazioni nel tempo che intercorre fra il campionamento e l’analisi. La perfetta conservazione del campione e dell’analita dipendono da un insieme di fattori, tra i quali: la temperatura di conservazione, il livello d’umidità, il pH, il contenuto di ossigeno, l’esposizione alla luce, tempo trascorso dal campionamento, Il contenitore del campione Il prelievo I problemi descritti si riducono quando le analisi vengono eseguite: -in situ -on line

14. SEPARAZIONE FISICA DURANTE IL CAMPIONAMENTO .

15. E’ possibile utilizzare la statistica per stabilire quanti campioni devono essere analizzati se si vuole essere certi, ad un certo livello di fiducia, che l’errore relativo sulla media dell’analisi non superi un valore definito. Per prima cosa occorre stabilire l’errore casuale relativo ad una singola analisi (s); se questa grandezza non è nota, è possibile determinarla effettuando un certo numero di analisi sullo stesso campione. L’intervallo di fiducia della media di un certo numero N di determinazioni è dato allora dalla equazione: L’obiettivo è quello di determinare un valore di N tale che, con la s del metodo in oggetto, l’intervallo di fiducia sia una definita frazione di. Se R è l’errore relativo massimo consentito, dovrà essere:

16. Da questa equazione si ricava facilmente il valore di N: La risoluzione di questa equazione non è però immediata, in quanto il valore di t, oltre ad essere legato al livello di fiducia richiesto, dipende anche da N. L’equazione può essere risolta per approssimazioni successive, cioè il risultato ottenuto ad un certo punto viene inserito nell’equazione per ottenere un nuovo valore di N, fino a che il risultato finale rimane costante. Ad esempio, assumendo che il livello di fiducia richiesto sia del 95%, si può partire dal valore di t relativo ad un livello di fiducia del 95%, ma per un numero infinito di campioni (t = 1,96). Si calcola quindi il valore di N, arrotondando all’intero immediatamente superiore, e sulla base di questo si determina un nuovo valore di t, che sarà maggiore del precedente. La procedura viene poi ripetuta fino ad ottenere due valori consecutivi di N coincidenti.

17. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE La preparazione del campione non deve comportare perdita di analita. Se non è possibile evitare la perdita di parte dell’analita, esistono opportune procedure, quali l’uso di uno standard interno, che permettono di quantificarla. La parte di analita che rimane disponibile per l’analisi definisce il recupero del procedimento analitico. La preparazione del campione dovrebbe trasformare l’analita nella forma più adatta per l’analisi.

18. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE La preparazione del campione dovrebbe includere la rimozione di tutti gli interferenti presenti nella matrice. Tutti i metodi analitici, in paticolare quelli caratterizzati da una bassa specificità, possono risentire di interferenze dovute agli altri costituenti del campione (matrice). L’eliminazione degli interferenti nella preparazione del campione migliora la specificità del metodo e permette di ottenere risultati più accurati. La preparazione del campione non dovrebbe aggiungere alcun nuovo interferente al campione stesso. La preparazione del campione dovrebbe includere, se necessario, anche stadi di diluizione o concentrazione dell’analita in modo da portare la sua concentrazione all’interno dell’intervallo ottimale del metodo analitico.

19. RECUPERO DELL’ANALITA L’analita si trova normalmente in una matrice dalla quale deve essere recuperato. La scelta del procedimento ottimale di recupero richiede, in linea di principio, la conoscenza di: Chimica degli analiti Chimica della matrice Chimica delle interazioni fra matrice ed analiti L’obiettivo è la separazione di tutto l’analita, nella forma chimica desiderata, dalla matrice e l’eliminazione delle fonti di interferenza.

20. RECUPERO DELL’ANALITA Le fonti più comuni che possono determinare una perdita di analita sono: Adsorbimento Evaporazione (per composti volatili) Processi di decomposizione (reazioni chimiche non previste, ossidazione di composti organici, processi fotochimici, degradazione batterica) Perdite durante i processi di trasferimento (in particolare per liquidi e gas) Il recupero di un metodo analitico viene quantificato attraverso la grandezza nota come recupero percentuale:

21. VARIAZIONE DELLA FORMA CHIMICA DEL CAMPIONE

22. VARIAZIONE DELLA FORMA CHIMICA DEL CAMPIONE

23. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE VARIAZIONE DELLA FORMA CHIMICA DEL CAMPIONE Alcuni comuni trattamenti operati sul campione sono: Polverizzazione – questo trattamento è in genere richiesto dalle tecniche che utilizzano direttamente il campione solido (analisi termiche, fluorescenza a raggi X, attivazione neutronica, tecniche di analisi di superficie). Trattamenti termici –fusione, conversione allo stato gassoso Dissoluzione – se il metodo analitico richiede il campione in forma liquida ed il solido fuso non è adatto occorre portare il campione in soluzione. Nei casi più semplici, se l’analita ed il campione lo permettono, la dissoluzione si può ottenere direttamente per trattamento del campione con un opportuno solvente, polare (acqua, alcooli) o apolare (solventi organici). Spesso il processo di dissoluzione può essere facilitato con mezzi fisici (agitazione, riscaldamento, dissoluzione assistita da ultrasuoni).

24. Nei casi più complessi, non è possibile ottenere la completa dissoluzione del campione se non operando in condizioni drastiche (digestione). In questo processo possono essere usati soluzioni di acidi, basi, agenti ossidanti o riducenti oppure enzimi, spesso a temperature relativamente elevate.

25. Una delle limitazioni del processo di digestione è che a causa delle condizioni drastiche parte dell’analita potrebbe andare perso a causa di processi di volatilizzazione. In questo caso la digestione potrebbe essere svolta in opportuni contenitori (bombe per digestione) destinati a questo scopo. Dopo la digestione ed il raffreddamento, i prodotti della reazione possono essere recuperati dal contenitore ed analizzati senza perdite. Mediante opportuni processi di digestione è ad esempio possibile eliminare tutte le sostanze organiche contenute in un campione: operando in condizioni fortemente ossidanti, i composti organici vengono eliminati, mentre quelli inorganici restano in forma di ceneri. La digestione può essere effettuata anche utilizzando metodi di riscaldamento non convenzionali: spesso si ottengono ottimi risultati utilizzando un processo di digestione assistito da microonde. Questo processo permette di mantenere sotto controllo sia la velocità di riscaldamento che la temperatura del campione in modo migliore rispetto ai metodi di riscaldamento comunemente utilizzati (piastre o mantelli riscaldanti).

26. Quando un processo di digestione in soluzione non è sufficiente, è possibile effettuare un trattamento ancora più energico. Nella fusione il campione viene trattato con un eccesso (10 o 20 volte la massa del campione) di fondente. Questi composti, solidi a temperatura ambiente, sono in genere acidi, basi o forti agenti ossidanti. Essi vengono riscaldati ad alta temperatura con il campione in modo da formare un fuso omogeneo; dopo la reazione, il fuso viene raffreddato ed il solido risultante viene disciolto in un solvente oppportuno. La maggiore efficienza della fusione rispetto alla digestione può essere attribuita ai seguenti fattori: Alta temperatura – la temperatura del fuso (300 – 1000 °C ed oltre) è molto maggiore di quella di ebollizione delle normali soluzioni acquose di acidi e basi (100 – 200 °C) Elevata concentrazione – la concentrazione effettiva del reattivo (10 – 20 M) è più elevata di quella delle soluzioni acquose (1 – 2 M) Alta reattività chimica – nella fusione il potere ossidante, come pure l’acidità o la basicità, del fondente non sono limitate dalla presenza dell’acqua.

27. Uno dei problemi che si incontrano nel processo di fusione è quello di trovare un contenitore sufficientemente resistente. In realtà spesso è impossibile trovare un contenitore completamente inattaccabile, e l’unica possibilità è quella di utilizzare recipienti di un materiale che non deve essere determinato e che comunque non interferisca nella procedura analitica.

28. Preprazione del campione RIDUZIONE DELLE INTERFERENZE Trasferire l’analita in una fase fisicamente separabile dalla matrice originale, dalla quale esso viene poi estratto e trasferito in una nuova matrice.

29. Preprazione del campione RIDUZIONE DELLE INTERFERENZE Nell’estrazione solido-liquido il campione solido viene trattato con un opportuno solvente in grado, almeno idealmente, di dissolvere l’analita ma non i costituenti della matrice. La preferenza dei vari componenti del campione per una fase oppure per l’altra può essere descritta quantitativamente attraverso il coefficiente di distribuzione KD. Tanto più è alto il valore di KD, tanto più il componente in oggetto è facilmente separabile dalla fase solida. Per ridurre poi al minimo il volume di solvente è possibile utilizzare apparecchiature apposite, come l’estrattore di Soxhlet, che permettono di effettuare numerosi stadi di estrazione, ognuno con solvente “fresco”, pur utilizzando una quantità ridotta di solvente. Procedure più drastiche di estrazione solido-liquido comprendono l’estrazione con fluidi supercritici (SFE) e l’estrazione acceleata con solvente (ASE) che utilizzano rispettivamente come agente estraente fluidi supercritici (ad esempio CO2) oppure solventi organici ad alta pressione, con il vantaggio di potere operare a temperature maggiori della normale temperatura di ebollizione del solvente stesso.

30. Preprazione del campione RIDUZIONE DELLE INTERFERENZE Un secondo tipo di estrazione molto utilizzata è l’estrazione liquido-liquido, nella quale la soluzione contenente l’analita viene estratta con un solvente immiscibile con essa. Molto utilizzata attualmente è anche l’estrazione in fase solida (SPE). Questo tipo di estrazione si effettua facendo passare la soluzione attraverso una fase solida che lega in modo selettivo gli analiti di interesse, ottenendo così una soluzione molto più concentrata rispetto alla soluzione di partenza. Altri vantaggi di questa tecnica di estrazione sono: Riduzione del volume di solvente organico richiesto per la preparazione del campione Possibilità di eseguire l’estrazione mediante procedure automatizzate

32. Preprazione del campione RIDUZIONE DELLE INTERFERENZE Dialisi - se analiti e componenti della matrice in soluzione sono costituiti da molecole di dimensioni sufficientemente diverse è possibile separare gli uni dalle altre mediante un procedimento di dialisi, basato sull’uso di membrane la cui porosità permette il passaggio soltanto delle molecole al di sotto di una certa dimensione. Precipitazione – analiti precipitabili possono essere ottenuti in forma insolubile, filtrati e ridisciolti in un altro solvente Purge and trap – analiti volatili possono essere estratti (purge) mediante questa tecnica,.

33. PREPARAZIONE DEGLI STANDARDS Per la verifica di una metodologia analitica è disponibili un’ampia gamma di materiali a composizione nota. Il più grande fornitore di materiali di riferimento è il National Institute of Standards and Technology (NIST), precedentemente noto come National Bureau of Standards (NBS). Esso distribuisce Materiali Standard di Riferimento (SRM), certificati dal NIST per una o più proprietà chimico-fisiche mediante (a) un metodo analitico di riferimento precedentemente convalidato, (b) due o più metodi di misurazione indipendenti ed affidabili, oppure (c) analizzati nell’ambito di una struttura di laboratori competenti ed aggiornati. Questi materiali vengono utilizzati per sviluppare metodi analitici, calibrare i sistemi di misurazione, definire i controlli di qualità e le prestazioni delle metodiche analitiche. L’Istituto distribuisce anche Materiali per Ricerca, non certificati ma comunque caratterizzati dal NIST, utilizzati allo scopo di fornire matrici omogenee per la messa a punto di metodiche analitiche, nonché Materiali di Riferimento Speciali, forniti da altri Enti e sviluppati per specifiche esigenze analitiche o di standardizzazione.

34. mA + nR AmRn A = analita R = reagente ANALISI Qualitativa Quantitativa - metodi classici (“chimici”) Analisi gravimetrica Analisi volumetrica - metodi strumentali Spettrocopici Cromatografici Elettrochimici a)Maggiore velocità di esecuzione b)Possibilità di eseguire ogni tipo di analisi c)Risparmio di tempo che, specialmente a livello industriale, può ammortizzare la spesa d)Altissima sensibilità e specificitàdel metodo di analisi a)Elevato costo di acquisto e/o di manutenzione dello strumento b)Trattamento preliminare del campione con metodi chimici c)Necessità di standard puri di riferimento per la taratura dell’apparecchio

35. IL PROCESSO ANALITICOQUANTO MATERIALE SI DEVE ANALIZZARE? La tecnica analitica da utilizzare dipende non solo della natura dell’analita e della matrice, ma anche delle dimensioni del campione e della quantità assoluta di analita in esso contenuta. Analizzare un campione di piccole dimensioni non è equivalente a determinare un analita presente in tracce in un campione di grandi dimensioni, anche se la quantità assoluta di analita può essere confrontabile. Componente principale: 1 – 100% Componente minore: 0,01 – 1% Componente in tracce: meno dello 0,01% = 100 ppm Componente in ultratracce: ppb o meno

36. IL PROCESSO ANALITICOQUANTO MATERIALE SI DEVE ANALIZZARE? L’eliminazione delle interferenze è una procedura sempre più problematica al diminuire della concentrazione dell’analita; a questo si aggiunge poi la sempre maggiore facilità di avere contaminazione dovuta all’ambiente o proveniente dai reagenti utilizzati nella preparazione del campione. Per concentrazioni dell’ordine delle ppb o meno, spesso si hanno deviazioni standard dello stesso ordine di grandezza delle concentrazioni da determinare.

37. CONCENTRAZIONE Numero di moli di materiale per L= molarità M Mole= quantità di una specie che contiene un n° di Avogadro (6,022X1023) di molecole Massa mlare o peso molecolare (PM)=massa in grammi di una mole di sostanza. Si Ottiene sommando le masse molari (massa di una mole) di tutti gli atomi che compaiono Nella formula Es. Formaldeide CH2O (1 mole X=12gr; 1 mole H=1 gr; 1 mole di O= 16 gr) PM= [12 + (2X1)+16]= 30 gr M=n° di moli di A/volume soluzione in litri= (massa di A in gr/PM di A)/ volume soluzione Es. M di 2 L di una soluzione contenete 5 g di formaldeide? M= (2/30)/2= 0.033 M Millimoli (mmol)=1/1000 di una mole Massa in grammi di una millimole= 1/1000 della massa molare Es. 1 mmoldi formaldeide = 30gr/1000= 0.03 g Molarità (M)= mmol/mL

38. CONCENTRAZIONE PERCENTUALE • Percentuale in peso (w/w)= (massa del soluto/massa della soluzione)X100% • Es. Per esprimere la c dei reagenti acquosi. Acido nitrico al 70% (w/w)= 70 gr di • Acido nitrico per 100 gr di soluzione ( e non di solvente) • Percentuale in volume (volume del soluto/volume della soluzione)X100% • Es. Viene usata per specificare la c di una soluzione ottenuta per diluizione • di un liquido puro con un altro liquido. Soluzione acquosa al 5% (v/v) di metanolo è • una soluzione preparata prendendo 5 mL di metanolo puro e acqua sufficiente ad • avere un volume di soluzione di 100 mL • Precentuale in peso-volume (w/v)= • (massa del soluto in gr/ volume della soluzione in mL)X100% • Es. Per indicare la c di soluzioni diluite di reagenti solidi. Nitrato d’argento al 5% (w/v) • È una soluzione ottenuta sciogliendo 5 g di nitarto d’argento in acqua sufficienti • A dare 100 mL di soluzione

39. CONCENTRAZIONE Si può esprimere anche in parti per milione (ppm) o parti per milardo (ppb). Un grammo di sostanza in questione è presente in un milione (o milardo) Di grammi di soluzione. La densità delle soluzioni acquose= 1g/mL. Quindi 1g di acqua corrisponde a 1 mL di acqua 1 ppm di una soluzione acquosa di A= 1 g di A/1000000 di gr di acqua= 1 gr di A/1000 L di A= 1000 mg/1000 L= 1mg di A/ 1 L 1 ppb=10-4 g di A/L

40. DILUIZIONE Sapendo che il numero di moli in una soluzione = M X V Le moli prelevate da una soluzione concentrata saranno uguali a: MconcX Vconc Dove: Mconc è la molarità della soluzione concentrata Vconc è il volume prelevato della soluzione concentrata E le moli nella soluzione diluita saranno uguali a: MdilX Vdil MconcX Vconc = MdilX Vdil Fattore di diluizione Es. La M di una soluzione di HCl concentrata è 12.1 M. Quanti mL devo prelevare per Preparare 1 L di soluzione 0.1M di HCl? (12,1)X (mL?) = (0.1) X (1000 mL) (mL?) = (0.1 X 1000)/12.1= 8.26 mL Occorre prelevare 8.26 mL di HCl concentrato e aggiungere acqua fino a 1 L per avere una soluzione di HCl ad una c finale di 0.1 M