Eiropas Sociālā fonda projekts “ Kapacitātes stiprināšana starpnozaru pētījumos biodrošībā ”

1. Biofilmu veidojošoS.epidermidiscelmu noteikšana, izmantojot fenotipiskās un molekulārās bioloģijas metodesIveta Līduma, Tatjana Tračevska, Uģis Bērs, Aija ŽilevičaLatvijas Universitātes Medicīnas fakultāte Bioanalītisko metožu laboratorija EiropasSociālāfondaprojekts “Kapacitātesstiprināšanastarpnozarupētījumosbiodrošībā” Nr.2009/0224/1DP/1.1.1.2.0/09/APIA/VIAA/055

2. Stafilokoki ir kļuvuši par vadošajiem nozokomiālo infekciju ierosinātājiem. • S.epidermidis bieži tiek izdalīts ar katetru lietošanu saistīto un ķirurģisko brūču infekciju gadījumos. • Stafilokoki labi adherējas pie medicīnā izmantojamo polimēru virsmām, veidojot biofilmas (protēzes, endotraheālās caurules u.c.) • Biofilmas veidošana ir viens no svarīgākajiem virulences faktoriem.

3. Biofilmas veidošanās notiek vairākos etapos. • Viens no galvenajiem biofilmas veidošanās komponentiem ir PIA -polisaharīdu starpšūnu adhezīns, tā sintēzi kodē ica ADBC operons. • Ar akumulāciju saistīto virsmas proteīnu AAP sintēzi nosaka gēns aap. • Gēniaapun icaA tiek izmantoti kā virulences marķieri.

4. Pētījuma uzdevumi • Fenotipiski raksturot biofilmu veidošanos, audzējot invitrobiofilmu stimulējošos apstākļos. • Ar molekulārās bioloģijas metodēm noteikt stafilokoku virulences faktoru gēnus – aapun icaA. • Salīdzināt invazīvo celmu mikroorganismu virulentās īpašības ar no veseliem cilvēkiem izdalītajiem S.epidermidis.

5. Tika pārbaudīti 79 S.epidermidis paraugi. • 59 bija klīniskie izolāti, kuri iegūti no pacientiem ar katetru lietošanu saistīto infekciju gadījumos (27), brūču infekciju (10) un bakterēmiju (22) gadījumos. • No veseliem cilvēkiem iegūtie S.epidermidis 20 paraugi (iztriepes no deguna) tika iekļauti kontroles grupā. • References celmi S.epidermidis ATCC 12228 un S.epidermidis ATCC 35984 tika izmantoti kā kontroles.

6. S.epidermidis uz i/v katetra virsmas Epifluorescentā m-sk. krāsots ar DAPI (100x) (1000 x)

7. S.epidermidisuz katetra virsmas

8. Sterils katetrs palielinājums 1000 x palielinājums100x

9. Congored agars • Ātrai un precīzai biofilmu veidojošo celmu noteikšanai tika izmēģināts Congored agars ar 1% glikozes piedevu.

10. Biofilmu veidošana mikrotitru platēkrāsots ar 0.4% safranīnašķ. Negatīvā kontrole Biofilmu veidojošie celmi Biofilmu neveidojošie celmi

11. Rezultāti • Starp klīniskajiem paraugiem abi gēni (icaA+ un aap+) tika noteikti: asins paraugos 9 (40,9%), izolātos no brūcēm divos paraugos, no katetriem izdalītajos celmos 10 (37%). • Kontroles paraugos (20) abi gēni tika noteikti vienā paraugā. • Kultivējot Congored barotnē 79 stafilokoku celmus un pēc tam salīdzinot ar noteiktajiem virulences gēniem aap+ un icaA+, saistība tika konstatēta 14 (17,7%) paraugos.

12. Rezultāti • Ar mikrotitru plates metodi tika pārbaudīti 47 celmi, analizējot rezultātus, konstatējām, ka biofilmu veidošanās mikrotitru platē 22 paraugos no hemokultūrām bija 8 (36,4%). • No 27 vēnu katetru paraugiem 14 (51,8%) gadījumos novēroja biofilmu veidošanos.

13. Secinājumi • Analizējot pētījuma rezultātus konstatēts, ka virulences faktori: gēni aap+ un icaA+ invazīvajos paraugos ir noteikti biežāk, salīdzinot ar kontroles grupas paraugiem. • Congored agaru, lai diferencētu biofilmu veidojošos celmus, nav ieteicams lietot stafilokoku heterogenitātes dēļ. • S.epidermidisvirulences izpēte jāturpina, apvienojot molekulārbioloģiskās un fenotipiskās izmeklēšanas metodes.

14. Paraugi tiek ievākti, pateicoties sadarbībai ar laboratorijām no vairākām Rīgas un Latvijas slimnīcām: Rīgas Austrumu klīniskā universitātes slimnīca, Traumatoloģijas un ortopēdijas slimnīca, P.Stradiņa klīniskā universitātes slimnīca, Latvijas Infektoloģijas centra TPSK, Ventspils slimnīca. • Pateicamies RTU Ūdens pētījumu laboratorijas vadītājam Prof. Tālim Juhna un Mg.biol. Lindai Mežulei par atsaucību un iespēju izmantot tehnisko aprīkojumu.