Les Méthodes de traçage des voies nerveuses

1. Les Méthodes de traçage des voies nerveuses Master 1 neuroscience Eléonore SERANO Romain TERROCHAIRE

2. Introduction: • La coloration des neurones morts est utilisée depuis plus de 100 ans, avec l'invention de la coloration de Golgi qui a permis la première description de réseaux de neurones (rendus visibles par du chromate d'argent sur tissus morts) • Transport antérograde identification des efférences • Transport rétrograde identification des cellules cibles d’une ou plusieurs cellules du SNC. • Marqueurs fluorescents les plus utilisés: • - PI • - NY • - RITC • - FB • En 1986, introduction des marqueurs de carbocyanine: DiO, DiI (marqueur post-mortem)

3. I. Méthodes et Généralités A. Injection: • Injection sous pression. • - FB, DY, dextrans aminés sont solubles • - carbocyanines nécessitent un solvant organique • Injection iontophorétique. • Cristaux de colorants (dyecrystals)

4. I. Méthodes et Généralités B. Absorption • Absorption active. • - dextrans aminés pour des axones lésées • - PI, FB pour des terminaisons intactes • Absorption passive • Injection intracellulaire • Transport et séquestration dans la cellule: • - Transport actif vésiculaire • - Diffusion latéral dans la membrane

5. I. Méthodes et Généralités C. Détection • Pour des marqueurs fluorescents: • - Directement visibles • - Possibilité d’utiliser plusieurs marqueurs en même temps • - Pas préservés sur coupe au cryostat ou paraffine • - Une trop forte fluorescence peut masquer de plus petits processus • Pour des marqueurs non fluorescents: • - anticorps spécifiques

6. Transport antérograde Transport rétrograde II. Les traceurs monosynaptiques • Les traceurs rétrogrades : Le marqueur va être absorbé aux niveau des terminaisons nerveuses et transféré vers le soma du neurone Utilisé lors de l’étude de la dégénération des axones projetant vers la région du cerveau qui a été détruite • Les traceurs antérogrades : Le marqueur est injecté au niveau du soma et sera transporté jusq’aux terminaisons nerveuses Cela permet le traçage de cibles anatomiques d’une population particulière de projection de neurones

7. II. Les traceurs monosynaptiques Les traceurs exclusivement antérogrades Les acides aminés radiomarqués : acides aminés tritiés, précurseur métabolique, neuro-transmetteur ou intermédiaire  autoradiographie Facilement transporté par des peptides nouvellement synthétisés Faible poids moléculaire Propriétés hydrophiles qui limitent la diffusion à l’intérieur de la matrice extracellulaire Sélectivité restreinte pour certaines cellules ou projections

8. II. Les traceurs monosynaptiques Les traceurs exclusivement antérogrades Les dextrans aminés: Facilement utilisable, injection par pression ou par iontophorèse Grandes variétés de méthodes de détections ont été développées pour eux Peuvent se conjuguer avec de nombreux colorants fluorescents Visibilité immédiate et production de préparation permanente Ex : Fluoro-Ruby, Fluoro-Emerald, Biotinylateddextran amines

9. II. Les traceurs monosynaptiques Les traceurs exclusivement rétrogrades HRP (Horse radish peroxydase ou péroxydase de raifort) : révélé par la DAB (diaminobenzidine) 1er traceur neuroanatomique rétrograde utilisé  L’absorption par les terminaisons nerveuses se fait par des vésicules qui contiennent l’enzyme Détection profite des propriétés enzymatique du traceur (DAB et TMB) Analyse de l’ultrastructure La coloration est incomplète et reste limitée au soma et aux dendrites primaires L’utilisation de trop grandes quantités de traceur peut compromettre la précision de la visualisation

10. II. Les traceurs monosynaptiques Les traceurs exclusivement rétrogrades Fluoro-gold, E. Coli enterotoxinsubunit B, billes microsphériques fluorescentes en latex • Marquage sur du long terme • Temps de survie 24h à 48h • Étiquetage pendant plusieurs mois

11. II. Les traceurs monosynaptiques Les traceurs antérogrades et rétrogrades • Les colorants de carbocyanides (DiI, DiO, DiAsp, DiA) • Utilisation in vivo ou in vitro • Fluorescence intense des voies de signalisation • Fort pouvoir lipophile • Diffusion axonale lente • Les lectines (WGA, PHA-L) • Les toxines bactériennes • (sous-unités b de la toxine du choléra) • Forte affinité pour de nombreux sucres • transport spécifique efficace • Se lie aux gangliosides présent sur la surface neuronale • Marque de grands réseaux neuronaux

12. II. Les traceurs monosynaptiques • Les marqueurs fluorescents (TRITC, FITC, FB, TB, rhodamine …) • Simple à utiliser • Forte sensibilité pour le traçage • Combinaison possible avec d’autres méthodes de traçage • Non dégradé avec le temps • La biocytine et neurobiotine • Marquage très fin des arborisations axonales • Faible poids moléculaire • Forte affinité pour l’avidine (détection)

13. III. Les traceurs transsynaptiques • Traceurs permettant la visualisation d’un réseau neuronal • traceurs pouvant passer les barrières synaptiques présentes entre les neurones Lectines, fucose radioactif, … Virus neurotropes modifiés (Herpès, rhabdovirus) Fragment C de la toxine tétanique WGA-HRP Diminution du signal dans le neurone de 2nd ordre, … Transport transneuronal de la périphérie Dépend des conditions expérimentales Les plus utilisés

14. III. Les traceurs transsynaptiques Les virus neurotropes : Transport de la périphérie jusqu’au système nerveux central Réplication dans les cellules hôtes après le transport neuronal Amplification du signal Détection des antigènes viraux dans le corps des cellules neuronales avec immunocytochimie

15. Conclusion • De nos jours nous possédons une palette de marqueurs • Ils sont soit antérogrades, soit rétrogrades ou les deux • Ils ont donc des applications différentes • La recherche de marqueur se poursuit • ex: WGA-HRP transgène

16. Merci de votre attention !