1 / 25

Projectvoorstel: Cytokine productie door probiotica als behandeling voor de ziekte van Crohn.

Projectvoorstel: Cytokine productie door probiotica als behandeling voor de ziekte van Crohn. Groepje 1: Coline Gerritsen Eric Lammertsma Frederik Verweij. Inhoud. Inleiding Achtergrond ziekte van Crohn Hoofdvraag Deelvragen Opzet van het onderzoek De experimenten Tijdsplanning

thad
Download Presentation

Projectvoorstel: Cytokine productie door probiotica als behandeling voor de ziekte van Crohn.

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Projectvoorstel:Cytokine productie door probiotica als behandeling voor de ziekte van Crohn. Groepje 1: Coline Gerritsen Eric Lammertsma Frederik Verweij

  2. Inhoud • Inleiding • Achtergrond ziekte van Crohn • Hoofdvraag • Deelvragen • Opzet van het onderzoek • De experimenten • Tijdsplanning • Relevantie en haalbaarheid

  3. Ziekte van Crohn • Ontstekingen in de digestieve tractus • Veel bewijs voor immunodeficiëntie • Neutrofielen deficiënt in: • Migratie of ‘chemotaxis’ • Superoxide generatie • Fagocytose • ‘Microbial killing’ • Opportunistische of pathogene bacteriën kunnen zich op het epitheel manifesteren

  4. Hoofdvraag Is het mogelijk om gemodificeerde probiotica te maken die door middel van het uitscheiden van cytokinen deficiënte neutrofielen kunnen stimuleren in hun functioneren en hiermee de ziekte van Crohn te kunnen behandelen?

  5. Deelvragen • Welke cytokinen stimuleren neutrofielen? • Is de stimulatie van deficiënte neutrofielen met cytokinen voldoende om hun functie te herstellen? • Kan een probioticum gemodificeerd worden om cytokinen te gaan produceren? • Heeft de toediening van gemodificeerde probiotica die cytokinen produceren tot resultaat dat de mate van ontstekingen bij de ziekte van Crohn vermindert? • Heeft de toediening van gemodificeerde probiotica ook bijwerkingen?

  6. Opzet van het onderzoek • Experiment 1: Cytokinen en neutrofielen • Experiment 2: Testen van de geschikte cytokinen op muizen • Experiment 3: Genetische modificatie van een probioticum om cytokinen te produceren • Experiment 4: Testen van een cytokine producerend probioticum op muizen • Experiment 5: Testen van een cytokine producerend probioticum op mensen

  7. Experiment 1:Cytokinen en neutrofielen • Fluorescentie bepaling van GFP-producerende bacterien • m.b.v. fluorescentie spectrofotometer • Gebruik maken van: • Deficiënte neutrofielen • Normaal functionerende neutrofielen • Cytokinen • GFP-producerende bacteriën

  8. IL-1 IL-1β IL-6 IL-8(/NAP-1) IL-18 IL-15 NAP-2 NAP-3 NAP-4 PAF IFN-γ TNF-α GM-CSF G-CSF MIP-1 MIP-2 Experiment 1:De cytokines

  9. Experiment 1: de opzet

  10. Opzet van het onderzoek • Experiment 1: Cytokinen en neutrofielen • Experiment 2: Testen van de geschikte cytokinen op muizen • Experiment 3: Genetische modificatie van een probioticum om cytokinen te produceren • Experiment 4: Testen van een cytokine producerend probioticum op muizen • Experiment 5: Testen van een cytokine producerend probioticum op mensen

  11. Experiment 2:testen van de geschikte cytokinen op muizen • Onderzoeken of: • De ernst van de ontstekingen verminderen • De cytokinen geen schadelijke effecten hebben op de muizen • Gebruik maken van modelmuizen • SAMP1/Yit muizen: spontane gastrointestinale inflammatie • Controleren op: • Algemene gezondheidstoestand • Ernst van de ontsteking

  12. Experiment 2:testen van de geschikte cytokinen op muizen • Uitvoering: • Modelmuizen cytokinen toedienen, in een vloeibare oplossing • Verschillende concentraties cytokinen • Modelmuizen vloeibare oplossing toedienen zonder cytokinen (ter controle) Alle groepen bestaan uit 5 muizen. Dagelijkse toediening gedurende 1 maand

  13. Opzet van het onderzoek • Experiment 1: Cytokinen en neutrofielen • Experiment 2: Testen van de geschikte cytokinen op muizen • Experiment 3: Genetische modificatie van een probioticum om cytokinen te produceren • Experiment 4: Testen van een cytokine producerend probioticum op muizen • Experiment 5: Testen van een cytokine producerend probioticum op mensen

  14. Experiment 3:Genetische modificatie van een probioticum om cytokinen te produceren • Genetische modificatie Lactococcus Lactis • Veilige bacterie • Eerder succesvol gemodificeerd • Methode volgens Lothar Steidler et al • Productie van een cytokine expressievector • Koppeling van geproduceerde cytokine aan bacteriële secretie signaalpeptide • Controle op cytokineproductie m.b.v. Western Blot

  15. Experiment 3:Genetische modificatie - Methode volgens Lothar Steidler et al • Expressieplasmide productie door E. Coli • kortstondige oligonucleotide-gemedieerde mutagenese • Vormt pLET2 secretievector • Bevat secretie signaalpeptide (L2) • T7 RNA polymerase promotie (P) • T7 terminator (T)

  16. Experiment 3:Genetische modificatie - Methode volgens Lothar Steidler et al • Plaatsing van restrictiesite (Nae I) • Tussen secretie-gen en terminator • Aanpassing van twee codons

  17. Experiment 3:Genetische modificatie - Methode volgens Lothar Steidler et al • Verwijdering van humaan secretiesignaal sequentie uit cytokine-gen (L) • Inbrengen van cytokinegen op NaeI-restrictiesite • Resultaat: T7 RNA polymerase gemedieerde productie van cytokine met bacteriële secretie signaalpeptide • Testen m.b.v. Western Blot

  18. Opzet van het onderzoek • Experiment 1: Cytokinen en neutrofielen • Experiment 2: Testen van de geschikte cytokinen op muizen • Experiment 3: Genetische modificatie van een probioticum om cytokinen te produceren • Experiment 4: Testen van een cytokine producerend probioticum op muizen • Experiment 5: Testen van een cytokine producerend probioticum op mensen

  19. Experiment 4: testen van een cytokine producerend probioticum op muizen • Onderzoeken of: • De ernst van de ontstekingen verminderen • De cytokine producerende probioticum geen schadelijke effecten hebben op de muizen • Gebruik maken van modelmuizen • SAMP1/Yit muizen: spontane gastrointestinale inflammatie • Controleren op: • Algemene gezondheidstoestand • Ernst van de ontsteking

  20. Experiment 4: testen van een cytokine producerend probioticum op muizen wordt • Uitvoering: • Modelmuizen gemodificeerde probiotica toedienen in een vloeibare oplossing • Verschillende concentraties probiotica • Modelmuizen ongemodificeerde probiotica toedienen in een vloeibare oplossing • Modelmuizen met ziekte van Crohn vloeibare oplossing toedienen zonder probiotica (ter controle) • muizen van het vorige experiment kunnen gebruikt worden. Alle groepen bestaan uit 5 muizen. 1 maand dagelijkse toediening

  21. Opzet van het onderzoek • Experiment 1: Cytokinen en neutrofielen • Experiment 2: Testen van de geschikte cytokinen op muizen • Experiment 3: Genetische modificatie van een probioticum om cytokinen te produceren • Experiment 4: Testen van een cytokine producerend probioticum op muizen • Experiment 5: Testen van een cytokine producerend probioticum op mensen

  22. Experiment 5: testen van een cytokine producerend probioticum op mensen • Onderzoeken of: • De ernst van de ontstekingen verminderen • Het cytokine producerende probioticum geen schadelijke effecten heeft op mensen • Controleren op: • Algemene gezondheidstoestand • Ernst van de ontsteking d.m.v colonoscopie

  23. Experiment 5: testen van een cytokine producerend probioticum op mensen • Opzet van het experiment: • Patiënten met de ziekte van Crohn gemodificeerde probiotica toedienen in een vloeibare oplossing • Patienten met de ziekte van Crohn ongemodificeerde probiotica toedienen in een vloeibare oplossing • Patienten met de ziekte van Crohn vloeibare oplossing toedienen zonder probiotica (placebo, ter controle) Alle groepen bestaan uit 50 patiënten. Gedurende 6 maanden dagelijkse toediening probiotica

  24. Tijdsplanning

  25. Relevantie en haalbaarheid • Ziekte van Crohn: • Incidentie: 5-10 per 100.000 per jaar • Prevalentie: 50-100 per 100.000 • Chronische aandoening • Eerdere onderzoeken: • Gemodificeerde bacteriën die cytokinen produceren (IL-2, IL-6, IL-10) • Veelbelovende resultaten met gemodificeerde bacterien die IL-10 produceren m.b.t. IBD

More Related