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Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica

Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica. Matías Möller Lab. Fisicoquímica Biológica Instituto de Química Biológica Facultad de Ciencias Universidad de la República. 7 de mayo de 2009. Bibliografía recomendada: Physical Biochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed. Cap. 15.

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Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica

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Presentation Transcript

  1. Fundamentos de Espectrometría de Masa Biológica Matías Möller Lab. Fisicoquímica Biológica Instituto de Química Biológica Facultad de Ciencias Universidad de la República 7 de mayo de 2009

  2. Bibliografía recomendada: Physical Biochemistry, Van Holde, 2006, 2nd Ed. Cap. 15. J. Chem. Ed., Vestling, 2003, Vol. 80, p.122. Introduction to proteomics, Liebler, 2002.

  3. Espectrometría de masa 1- Generalidades 2- MALDI-TOF 3- ESI-Q 4- Peptide Mass Fingerprinting y tandem MS

  4. Espectrometría de masa 1- Generalidades

  5. Espectrometría de masa Técnica que permite la separación y determinación de la relación masa/carga de iones gaseosos

  6. Espectrometría de masa Espectrometría ≠ Espectroscopía (Medición de un rango) (implica absorción o emisión de energía radiante)

  7. Espectrometría de masa Espectrometría de masa de Biomoléculas • Determinación de masa y/o composición: • Péptidos, Proteínas, Complejos Supramoleculares • Polisacáridos, oligosacáridos • Lípidos  Lipidoma • Fragmentos de ácidos nucleicos Técnica muy sensible: puede analizar mg-ng (y menos) de material

  8. Espectrometría de masa Espectrometría de masa de Proteínas • Determinación de masa y/o composición • Identificación por comparación con bases de datos (peptide mass fingerprint) y secuenciación de péptidos • Modificaciones postraduccionales • Complejos Supramoleculares: Interacción entre proteínas Interacción con compuestos de bajo PM • Plegamiento • Niveles de expresión/modificación posttraduccional

  9. Gel 2D de hígado humano http://ca.expasy.org/swiss-2dpage/

  10. Espectrometría de masa cyt C ~ 12000 Da

  11. Espectrometría de masa Espectrometría de masa biológica Lisozima

  12. Espectrometría de masa PM(péptido) = 1162 Da Modo positivo Modo negativo m = +1 +23 +39 -1

  13. Espectrometría de masa Los Iones son importantes En el proceso de Ionización se forman diferentes tipos de iones  cambios en m/z: [M+H]+o[M-H]- De la protonación o deprotonación de aminas, carboxilos, fenoles, fosfatos, sulfatos (pueden ser [M+2H]2+, [M+nH]n+) [M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+, [M+Cl]- De la unión de iones especialmente a moléculas que contienen oxígeno (Na = 23 Da; K = 39 Da) [M]*+, [M]*- (oxidación o reducción monoelectrónica-no muy común)

  14. Espectrometría de masa Espectrómetro de masa Muestra Entrada: Volatilización/ Ionización Analizador de masas Detector MALDI ESI TOF Cuadrupolo Tampa de Iones FTICR Sector Magnético Alto Vacío

  15. Espectrometría de masa ¿Cómo volatilizar una proteína? Premio Nobel de Química 2002 Fenn (1988)- ESI: Electrospray Ionization Tanaka (1988)- LDI: Laser Desorption/Ionization Sin Premio: Karas y Hillenkamp (1988)- MALDI: Matrix Assisted LDI (como se usa ahora, pero Tanaka hizo volar una proteína antes)

  16. Espectrometría de masa Espectrómetros de masa (configuraciones para grandes biomoléculas) MALDI-TOF: Matriz Assisted Laser Desorption/Ionization- Time of Flight ESI-Q: ElectroSpray Ionization-Quadrupole ESI-IT: ElectroSpray Ionization-Ion Trap ESI-FTICR: Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance

  17. Espectrometría de masa 2- MALDI-TOF

  18. Espectrometría de masa Ionización por MALDI: (Matrix assisted Laser desorption/ionization) Las Biomoléculas se mezclan con una matriz que absorbe energía de un laser y al disiparla produce la coevaporación de la muestra: La energía agregada hace que la matriz “explote”, llevando la proteína cargada hacia la entrada del analizador. El proceso de desorción está asociado con una transferencia de H+. Las proteínas cargadas son dirigidas al analizador mediante un campo eléctrico

  19. Espectrometría de masa MALDI-TOF Matriz

  20. Espectrometría de masa MALDI Desorción/Ionización por Laser Asistida por Matriz

  21. Espectrometría de masa MALDI-TOF Se determina la masa de las moléculas cargadas de acuerdo a su “tiempo de vuelo”(t). t  (m/z)1/2 las partículas con menor m/z llegan antes al detector No tienen muy buena resolución, pero son robustos, simples y tienen un virtualmente ilimitado rango de masas (300 kDa)

  22. Espectrometría de masa MALDI-TOF Los iones positivos generados en la fuente por MALDI son acelerados por un campo eléctrico E, que le imparte una energía cinética: Ek = zeEs donde s es la distancia de la región de la fuente. Entonces entran a una región (tubo) sobre la que no actúa ningún campo. los iones con igual carga tienen la misma Ek, ½mv2 = zeEs  v = (2zeEs/m)½ t = D/v = (m/2zeEs)½D  m/z = 2eEs(t/D)2

  23. Espectrometría de masa MALDI-TOF Sin E, iones a la deriva E + - Fig. Separación por TOF + + + + D s Detector Fuente ½mv2 = zeEs  v = (2zeEs/m)½ t = D/v = (m/2zeEs)½D  m/z = 2eEs(t/D)2

  24. Espectrometría de masa Tubo de vuelo 4-25 kV Detector Carlos Cerveñansky

  25. Espectrometría de masa Tubo de vuelo 4-25 kV Detector Carlos Cerveñansky

  26. Espectrometría de masa MALDI-TOF

  27. Espectrometría de masa MALDI-TOF Fig. Espectro de masas por MALDI-TOF

  28. Espectrometría de masa MALDI-TOF

  29. 1672.92 Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM) Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM) Resolución en MALDI-TOF Carlos Cerveñansky

  30. Espectrometría de masa Los Isótopos son importantes • Los espectrómetros de masa diferencian entre isótopos • Pesos moleculares: Unidades de masa atómica (amu), • se basa en una escala relativa al 126C = 12 amu • 1 amu = 1 dalton = 1.66054 x 10-24 g Abundancia isotópica: • 12C 12.0000 98.90 % • 13C 13.0034 1.10 %

  31. Carlos Cerveñansky

  32. Carlos Cerveñansky

  33. Voyager Spec #1=>MC[BP = 2469.5, 12005] % Intensity 2xC13 Espectro de masa con resolución isotópica de insulina bovina. (aprox. 0.15 pmoles, 0.8 ng, en 1 ml de muestra; matriz: CHCA; R= 13800 FWHM) 2093 100 C13 90 80 70 60 C12 50 40 30 20 10 0 0 5725 5729 5733 5737 5741 5745 Mass (m/z) Carlos Cerveñansky

  34. Espectrometría de masa MALDI-TOF

  35. Espectrometría de masa 3- ESI-MS

  36. Espectrometría de masa ESI-Q ElectroSpray Ionization - Quadrupole Las Proteínas se introducen al analizador por un capilar sometido a un fuerte voltaje, rodeado por un flujo de N2 (gas secante). El fuerte voltaje hace que se formen gotas muy pequeñas cargadas (spray), donde el solvente termina de evaporarse y las proteínas cargadas viajan hacia el analizador El Analizador es un “filtro de masa” cuadrupolo

  37. Espectrometría de masa ESI N2

  38. Espectrometría de masa ESI

  39. Espectrometría de masa ESI-Q Al analizador de masas de Cuadrupolo se le llama “Filtro de Masas” porque normalmente transmite iones de un pequeño rango de m/z, todos los otros iones son neutralizados y eliminados. Variando las señales eléctricas de un cuadrupolo es posible variar la m/z y realizar un barrido espectral Consiste en cuatro barras cilíndricas metálicas que sirven de electrodos del filtro de masas Robustos, baratos y tienen tiempos de barrido breves, no tienen muy buena resolución y el rango de m/z llega hasta 3000

  40. Espectrometría de masa ESI-Q

  41. Espectrometría de masa ESI-Q

  42. Espectrometría de masa ESI-Q

  43. Espectrometría de masa 14+ 13+ 12+ 11+ 11+ 10+ 10+ 9+ 9+ ESI-MS Deconvolución del espectro FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)

  44. Espectrometría de masa 14+ 13+ 12+ 11+ 11+ 10+ 10+ 9+ 9+ ESI-MS Deconvolución del espectro FMN-bp (Desulfovibrio vulgaris)

  45. Espectrometría de masa (n+1)+ n+ ESI-MS Deconvolución del espectro x1 = (M+n)/n x2 = (M+n+1)/(n+1)  n = (x2-1)/(x1-x2) n = (1084.1-1) / 72.1 = 15 M = (1156.2 x 15) -15 = 17328

  46. Espectrometría de masa ESI-MS Deconvolución del espectro Mioglobina de caballo

  47. Espectrometría de masa ESI-MS Deconvolución del espectro Bajo PM Alto PM

  48. Espectrometría de masa ESI-MS

  49. Espectrometría de masa Comparación ESI-MS y MALDI-TOF Cyt C

  50. Espectrometría de masa Comparación

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