Studi in campo per la determinazione dell’insorgenza di fenomeni di resistenza alla tossina del Bt

1. Valutazione rischio ambientale biotecnologie Studi in campo per la determinazione dell’insorgenza di fenomeni di resistenza alla tossina del Bt BRAZZI ANDREA

2. CHE COSA E’ IL Bt • Il Bacillus thuringiensis (Bt) è un batterio naturale,presente nel terreno, che ha la caratteristica di produrre proteine insetticide • durante la sporulazione • Ogni ceppo produce la propria tossina insetticida che è codificata da un singolo gene presente nel plasmide nel batterio • L'insieme delle tossine prodotte da Bt interessano una varietà di specie che và dal Coleoptera (scarabei), alla Lepidoptera (lepidotteri e farfalle) • e alla Diptera (mosche e zanzare) • Le tossine di Bt, classificate in 34 sottogruppi, sono biodegradabili • e non sono persistenti nell'ambiente

3. ALCUNI CENNI STORICI…… • Il Bacillo thuringiensis è stato commercialazzato come insetticida in Francia nel 1938 e negli Stati Uniti intorno agli anni 50’ • Negli anni 80 l'interesse commerciale per il Bt ha portato a uno sviluppo elevato di altrettanti insetticidi sintetici che presto si sono dimostrati inefficaci • a causa della resistenza dell'insetto • Le prime piante transgeniche che hanno espresso le tossine Bt sono state quelle di pomodoro e di tabacco; mentre oggi i raccolti transgenici Bt piùimportanti • includono anche cereali, cotone, patate e riso • Il cereale di campo Bt è stata la prima pianta-antiparassitaria Bt registrata • presso l'ente per la salvaguardia dell'ambiente (USEPA) • degli Stati Uniti nel 1995

4. ALCUNI VANTAGGI E SVANTAGGI NELL’USO DEL Bt….. • L'ingegneria genetica nelle piante per l’epressione delle tossine Bt è particolarmente utile contro i parassiti che attaccano le parti • della pianta che solitamente non sono ben protette • dall'applicazione convenzionale dell'insetticida • La tecnologia Bt ha il suo principale vantaggio nella riduzione dell’immissione nell’ambiente di pesticidi e antiparassitari conferendo alle stesse piante • la capacità di resistere a insetti nocivi e parassiti • Diversamente dai pesticidi più comuni, che non sono specifici nella loro azione, le tossine Bt sono molto specifiche su gli insetti nocivi e non hanno • effetti letali sulla maggior parte degli insetti “buoni” • Insorgenza della resistenza: infatti la resistenza dei parassiti agli insetticidi è un fenomeno presente in tutto il mondo e gli ultimi studi indicano che oltre 500 specie di insetti hanno sviluppato resistenze a uno o più antiparassitari

5. La tecnologia Bt è ha assunto un ruolo • importante nell'agricoltura: • Nel mondo, secondo una stima risalente al 2002, ci sono 14.5 milioni • di ettari di terra coltivati con piante Bt • Nel 1997 le coltivazioni Bt di cotone, mais e patata hanno occupato quasi • 10 milione di acri di terra solo negli Stati Uniti; inoltre questi raccolti sono coltivati • su larga scala in Canada, in Giappone,in Messico, in Argentina e in Australia • Degli 8 miliardi di $ spesi annualmente negli USA per gli insetticidi è stato valutato che quasi 2,7 miliardi di $ potrebbero essere risparmiati con • l’applicazione biotecnologica del Bt • * Dalla commercializzazione del cotone transgenico Bt nel 1996, gli spruzzi • d’insetticida su cotone negli Stati Unitisono stati ridotti a circa 3,8 milioni • litri di prodotto all'anno portando a una riduzione significativa • nell'uso di insetticidi e pesticidi potenzialmente nocivi • * Insect Resistance and the Future of Bt Transgenic Plants. • M. Shelton and J. Z. Zhao, Cornell University, USA. ISB May 2000.

6. RAPPORTI SULLA RESISTENZA AL Bt I prodotti Bt sono stati usati per più di 40 anni come insetticida senza alcuna prova di resistenza né in campo nè in laboratorio fino a quando nel 1990 i primi rapporti su alcune coltivazioni provenienti dall'Hawai, dalla Florida hanno messo in luce il fenomeno della resistenza: La falena notturna Plutella xylostella, apparetnente alla specie Lepidoptera, è stata trovata essere resistente dopo trattatamento con formulazioni spray di tossine Bt Successivamente, dopo uso intenso di prodotti Bt, la resistenza in Plutella xylostella è stata rilevata in altri paesi come il Giappone, la Cina, le Filippine e la Tailandia Durante questi anni, da quando la resistenza di Bt è stata scoperta, sono state selezionate in laboratorio popolazioni resistenti per un totale di tredici specie di insetti Nonostante nessuna di queste specie abbia sviluppato la resistenza in campo, le ricerche di laboratorio indicano che il pericolo del potenziale sviluppo di resistenza è reale

7. Le piante transgeniche possono agire, in seguito alla introduzione nell’ambiente • di nuovi geni, come un fattore selettivo determinando l’insorgenza • di fenomeni di resistenza in insetti e parassiti • Attuato un programma chiamato Resistance Management con l’obbiettivo non di arrestare completamente la resistenza, ma ritardarne • il più possibile lo sviluppo • Gli obiettivi della Resistance Managementsono tre: • evitare la resistenza quando e dove è possibile • ritardare la resistenza più lungamente possibile • ottenere popolazioni resistenti revertenti

8. Sono stati usati due approcci di base diversi: • 1: Minimizzare l'esposizione alle tossine e/o di tenere conto del rapporto fra • gli insetti resistenti e la popolazione degli insetti suscettibili: • Ingegnerizzare le piante in modo che almeno una percentuale • di individui suscettibili possa sopravvivere • Inserire in campi transgenici zone di “rifugio” composte • da piante non modificate geneticamente • 2: Combinare le diverse tecniche di controllo del parassita basandosi sul presupposto che è più probabile che un insetto sviluppi simultaneamente la resistenza a un tipo • di controllo che a più di uno: • Combinazioni di tossine con modi completamente differenti di azione • Sviluppare piante con una espressione della tossina controllabile nel tempo • Utilizzare le “pyramided plants”, piante con due geni differenti codificanti • entrambi per due tossine Bt diverse

9. Modello “DBM/Bt crops” • Field tests on managing resistance to Bt-engineered plants. • Anthony M. Shelton, Juliet D. Tang, Richard T. Roush,Timothy D. Metz and Elizabeth D. Earle. • Volume 18 march 2003 nature biotechnology • PRIMA PARTE • Obiettivo: • Qual è la tipologia del “refuge” più efficace • nello svolgere la sua funzione? • Premessa: • I tre fattori che concorrono nel ritardare l’insorgenza di • genotipi resistenti sono: • Alto dosaggio genico • Elevati quantitativi iniziali di pesticidi • Presenza di “zone rifugio”

10. Analisi della metodologia “refuge” • Cos’è una zona “rifugio”? • È un lotto di terreno coltivato in cui vengono seminate piante non modificate geneticamente • Il “rifugio” può variare nel formato e nella disposizione e serve come • serbatoio degli insetti suscettibili(SS) Coltivazione Bt con “separated refuge” Coltivazione Bt con “mixed refuge” Pianta Bt Pianta non Bt Pianta Bt Pianta non Bt

11. La metodologia del ”rifugio” è basata sul rilascio periodico di insetti maschi suscettibili in una popolazione trattata con Bt Seminando lotti di terreno con piante non Bt è possibile ritardare l’insorgenza di omozigoti resistenti (RR) nelle popolazioni di insetti, cercando di mantenere una buona percentuale di genotipi omozigoti ed eterozigoti suscettibili (SS e SR) • Perché il metodo del “refuge” abbia un buon successo: • La resistenza deve essere un carattere recessivo • L’accoppiamento deve essere casuale • Gli adulti devono migrare tra le piante trattate con Bt

12. Materiale • Broccoli (Brassica oleracea)Bt Cry1A (Monsato) • Falene notturne (Plutella xylostella) • Esperimenti preliminari in serra • Le falene sono state disposte in gabbie contenenti diverse percentuali • di broccoli Bt e non Bt • Dopo un certo numero di generazioni le larve di Plutella xylostella sono state analizzate per verificare l’insorgenza di resistenza verso la tossina Cry1A • In assenza di un “rifugio” si osserva un aumento molto rapido di larve resistenti • Il “mixed refuge” è meno efficiente rispetto al “separate refuge” nel • ritardare l’insorgenza di individui Bt resistenti

13. 1996 Field tests - Tipologia del rifugio (mixed vs. separate) - Distribuzione delle larve su piante Bt e non RISULTATI: Il “separate refuge” permette una maggior conservazione del numero di alleli suscettibili, in quanto le larve possono sopravvivere fino allo stadio adulto (SR o SS) e incrociandosi con individui RR possono portare ad una diminuzione della progenie RR

14. Questi dati concordano con la capacità degli insetti di muoversi come larve da una pianta ad un’altra Se il movimento avviene con la tipologia del “rifugio” separato si ha la sopravvivenza delle larve, nel caso opposto la percentuale di individui SS o SR diminuisce PIU’ IN GENERALE SE UN INSETTO (ADULTO O ALLO STADIO LARVALE) DIVENTA RESISTENTE VERSO UNA TOSSINA BT IL SUO TASSO DI MORTALITÀ DECRESCE QUANDO CI SI TROVA IN PRESENZA DELL’AGENTE SELETTIVO

15. Seconda parte • Premessa: • In termini di produttività quanto è disposto un agricoltore a concedere alle coltivazioni non Bt rispetto a quelle transgeniche per evitare • l’insorgenza di fenomeni di resistenza? • Quali dimensioni deve avere il rifugio per svolgere la sua funzione? • Obiettivo: • Verificare se il trattamento del “rifugio” con un insetticida altamente efficace “diluisca” il numero degli insetti suscettibili a tal punto che il • rifugio stesso sia reso inefficace

16. Normative sulla dimensione della “zona rifugio” per le coltivazioni Bt: EPA (Environment Protection Agency) La “zona rifugio” deve essere composta da un 20% di piante non Bt se su di essa viene utilizzato un pesticida spray. La dimensione della “zona rifugio” può essere invece portata al 4% se non viene trattata con alcun pesticida CFIA (Canadian Food Inspection Agency) La zona di coltivazioni non Bt deve essere del 20% e non deve essere trattata con nessun tipo di pesticida, deve trovarsi ad una distanza non superiore a ¼ di miglio dalla “ zona Bt ” e deve creare una cintura di sicurezza intorno ai campi coltivati con piante Bt, creando una struttura ordinata

17. 1997 Field tests Senza rilascio iniziale - Analisi della mortalità in seguito all’utilizzo di pesticidi - Valutazione del livello di resistenza Con rilascio iniziale No spray Spray Conclusione: Utilizzando un pesticida M-C (Mycogen, encapsulated Cry1C) sui lotti di colture non Bt si diminuisce la capacità di poter “diluire” il crearsi di una progenie RR • Risultati: • La mortalità prima del rilascio sulle colture Bt è del 27% • La mortalità sia nel caso del “100% rifugio” con rilascio iniziale • di insetti che in quello senza ha un incremento del 70% • Tra il 2° e il 3° periodo nel “20% spray refuge” la mortalità • scende del 15% rispetto agli insetti nel “non spray refuge”

18. Analisi della popolazione totale di larve nel “20 % refuge” • trattato con e senza pesticida La strategia migliore da attuare è quella di abbinare a una “zona rifugio” non spruzzata con pesticidi piante che esprimono alti livelli di tossine Bt per cercare di evitare il formarsi di un elevato grado di resistenza Spruzzando le zone “rifugio” con pesticida, la loro potenzialità di ritardare l’insorgere di individui resistenti tende a calare vistosamente

19. Utilizzo di “pyramided plants” • Transgenic plants expressing two Bacillus thuringiensis toxins delay insect resistance evolution. • Jian-Zhou Zhao, Jun Cao, Yaxin Li, Hilda L Collins, Richard T Roush, Elizabeth D Earle & • Anthony M Shelton. November 2003 Nature Biotechnology  • Metodologia • Analisi comparativa del meccanismo dell’insorgenza di fenomeni di resistenza in una popolazione di insetti (DBM) con una percentuale nota di alleli resistenti • (Cry1Ac e Cry1C) quando tali individui vengono esposti a piante • che esprimono le tossine in modo: • Sequenziale(rilascio delle tossine in successione) • Simultaneo(“pyramided plants”) • e attraverso la coltivazione in mosaico • (tipo di rifugio in qui le zone non-Bt, anziché non essere trattate, sono spruzzate • con un insetticida diverso da quello utilizzato nella zona Bt) • Obiettivo • Cercare di confermare i modelli teorici secondo cui le “pyramided plants”hannopotenzialità maggiori nel contrastare l’insorgenza di individui resistenti • rispetto alle altre tipologie di piante

20. Materiale • Piante di broccoli (Brassica oleracea) trasformate per esprimere differenti tossine Cry: • Solo la tossina Cry1Ac • Solo la tossina Cry1C • Entrambe le tossine • Quattro popolazioni di falene notturne (Plutella xylostella): • Resistente a solo la tossina Cry1Ac • Resistente a solo la tossina Cry1C • Resistente a entrambe le tossine • Non resistente • Tabella riassuntiva della distribuzione delle piante nei lotti sperimentali Piante Cry 1Ac Piante Cry 1C Entrambi i geni Piante rifugio Mosaic plants 40% 40% - 20% Sequential plants 40% 40% - - 20% Piramyded plants - - 80% 20%

21. Analisi della densità di popolazione per i diversi trattamenti Cry1Ac S. Frequenza genica iniziale di resistenza delle larve sulle piante Bt: Cry1Ac: 0.20 Cry1C: 0.10 Cry1Ac-Cry1C: 0 Dalla quarta generazione si osserva un incremento sulle piante Cry1Ac sia a mosaico che sequenziali Dalla 9°generazione la percentuale di larve è maggiore sulle “piante a mosaico” Cry1Ac che non su quelle Cry1C; nella 24° è la più alta Al termine del periodo di campionamento anche le piante “sequenziali” Cry1C mostrano un discreto numero di larve, ma sempre inferiore se paragonato alle piante Cry1Ac Le piante con due geni mostrano comunque un numero di larve inferiore rispetto alle altre due tipologie Cry1Ac M. Cry1C M. Cry1C S.

22. Analisi dei dati sulla resistenza • Dopo 18 e 24 generazioni si riscontra una certa percentuale di larve resistenti • verso le tossine Cry provenienti da piante “non piramidali” • Alla ventiquattresima generazione la percentuale delle larve resistenti cresciute su piante che esprimono entrambe le tossine è invece nulla

23. Conclusioni sull’esperimento Resistenza alla tossina Cry1Ac I dati trovati per la resistenza alla tossina Cry1Ac concordano con quelli ottenuti attraverso la modellistica, le cui condizioni erano che la percentuale iniziale degli omozigoti resistenti fosse dello 0.1% e che solamente tali genotipi potessero sopravvivere alla crescita su piante Bt Cry1Ac Distribuzione a mosaico: la frequenza delle larve omozigoti resistenti potrebbe raggiungere una percentuale pari all’ 80% entro la dodicesima generazione e del 95% entro la diciottesima Distribuzione sequenziale: la frequenza delle larve omozigoti resistenti potrebbe raggiungere una percentuale pari all’ 60% entro la settima generazione Piante con i due geni Cry: la frequenza delle larve omozigoti resistenti si mantiene più bassa che nei due casi precedenti Resistenza alla tossina Cry1C La resistenza in questo caso emerge troppo lentamente per permettere di trarre conclusioni solide, probabilmente a causa della tipologia del meccanismo di acquisizione della resistenza per cui sono ancora in corso studi di mappaggio genico per individuare il gene che conferisce resistenza alla tossina Cry1C

24. Le soluzioni valutate per sviluppare una buona • “resistance management strategy” nei lavori esaminati sono state: - Presenza di una zona rifugio - Utilizzo di piante Bt che esprimano alti livelli di tossina - Impiego di alti dosaggi di pesticida • Impiego di piante che esprimano geni per due tossine Bt che • non diano resistenza incrociata • Più in generale: • La frequenza iniziale degli alleli di resistenti deve essere bassa • Valutare i flussi migratori degli insetti di interesse • Organizzare piani di studio programmati nel tempo per valutare la • percentuale di genotipi RR

25. IL FUTURO • Attualmente è in studio una nuova tecnica di ingegneria genetica: • L’espressione tempo-specifica della tossina per permettere l’espressione della tossina soltanto nei tessuti danneggiati con il risultato di ottenere l'esposizione della tossina soltanto se necessario • La ricerca futura dovrebbe riuscire a colmare le lacune nella conoscenza sia per quanto riguarda il comportamento che le caratteristiche della resistenza del • parassita che non sono ancora completamente chiare • Ulteriori studi sul Bacillus thuringiensis potranno portare all'individuazione di altri batteri che potrebbero avere applicazioni simili nell'agricoltura • In conclusione, le applicazioni biotecnologiche applicate alla Resistance Management possono dare sia vantaggi che svantaggi e solo ulteriori • ricerche possono dirci in quale direzione bisogna andare

26. Bibliografia • Field tests on managing resistance to Bt-engineered plants. • Anthony M. Shelton , Juliet D. Tang , Richard T. Roush 3,4 , Timothy D. Metz and Elizabeth D. • Earle. volume 18 march 2003 nature biotechnology. • Transgenic plants expressing two Bacillus thuringiensis toxins delay insect resistance • evolution. • Jian-Zhou Zhao, Jun Cao, Yaxin Li, Hilda L Collins, Richard T Roush, Elizabeth D Earle & • Anthony M Shelton. 9 November 2003 nature biotechnology, doi:10.1038/nbt907   • Are Bt crops safe? • Mike Mendelsohn, John Kough, Zigfridais Vaituzis & Keith Matthews. • volume 21 number 9 september 2003 nature biotechnology. • Managing Resistance to Bacillus thuringiensis Toxins. • Camilla C. Neppl B.A. Thesis Environmental Studies University of Chicago May 26, 2000 • Insect Resistance and the Future of Bt Transgenic Plants. ISB May 2000. • M. Shelton and J. Z. Zhao, Cornell University, USA

27. Piante Bt brevettate da 1995 al 2001 *

28. Un'alternativa alla strategia di avere un “rifugio” del 20% che può essere spruzzato può essere attuare la normativa sulla dimensione della “zona rifugio” per le coltivazioni Bt approvata dall’EPA (Environment Protection Agency) La zona “rifugio” deve essere composta da un 20% di piante non Bt se su di essa viene utilizzato un pesticida spray. La dimensione della zona “rifugio” può essere invece portata al 4% se non viene trattata con alcun pesticida CFIA(Canadian Food Inspection Agency) La zona di coltivazioni non Bt deve essere del 20% e non deve essere trattata con nessun tipo di pesticida, deve trovarsi ad una distanza non superiore a ¼ di miglio dalla “ zona Bt ” e deve creare una cintura di sicurezza intorno ai campi coltivati con piante Bt, creando una struttura ordinata

29. 1997 field tests • Analisi del numero di larve per pianta Bt nel “20% refuge” • trattato con e senza pesticida spray no spray Spray Viene confermato il dato precedente, in quanto utilizzando M-C, sulle piante Bt si ha lo sviluppo di larve di DBM resistenti Questo è evidenziato dall’aumento del numero di larve su broccoli Bt nei lotti rifugio irrorati con pesticida e dalla diminuzione su piante Bt non trattate