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Preparo das amostras para espectrometria de massa

Preparo das amostras para espectrometria de massa. Fabiane Maria Lima Sousa Mestranda PPGZ-UFC Orient.: Prof.: Arlindo Moura. A digestão é necessária para que todas as partes da proteína fiquem uniformemente expostas à dissociação e ionização, e para aumentar a eficiência desses processos.

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Preparo das amostras para espectrometria de massa

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Presentation Transcript

  1. Preparo das amostras para espectrometria de massa Fabiane Maria Lima Sousa Mestranda PPGZ-UFC Orient.: Prof.: Arlindo Moura

  2. A digestão é necessária para que todas as partes da proteína fiquem uniformemente expostas à dissociação e ionização, e para aumentar a eficiência desses processos. • As bandas/spots protéicos correspondentes à proteína de interesse serão: • Excisadas • Descoradas • Submetidas à digestão enzimática

  3. Imagem gerada pelo PDQuest: Master gel

  4. Proteases normalmente utilizadas: • Quimotripsina • Pepsina • Carboxipeptidases • Aminopeptidases • Tripsina ou uma combinação delas • Capacidade • Previsibilidade • Disponibilidade

  5. Cuidados no procedimento • Manter o gel umedecido com água destilada para evitar o ressecamento. • Deve-se usar reagentes de boa qualidade e procedência conhecida. • Durante os procedimentos de corte e digestão, é importante o uso de luvas, jaleco de mangas compridas, e, se possível, touca e máscara, para evitar contaminações, a principal é a queratina humana.

  6. Etapas do procedimento • Excisão ou corte dos spots • Spot no gel, é cortado no centro e dividido em pedaços menores. • Existem os métodos manuais (tesoura, bisturi ou gilete), e existe um método computadorizado (spot picker).

  7. Excisão manual com bisturi

  8. Método computadorizado (Spot picker)

  9. Lavagem do gel • Solução de acetonitrila/bicarbonato de amônio • Desidratado o gel com acetonitrila • Remover a acetonitrila e secar completamente os géis no Speed Vac.

  10. Digestão com tripsina • Solução de tripsina diluída será distribuída de forma a cobrir os pedaços de gel. • Extração dos peptídeos (por meio de lavagens)com ácido fórmico 5% ou TFA 5%/ acetonitrila 50%. • Concentrar as amostras .

  11. Obrigada fmlsousa@gmail.com

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