EKSTRAKSI DAN PENGUJIAN AKTIVITAS AMILASE

1. EKSTRAKSI DAN PENGUJIAN AKTIVITAS AMILASE By: Irma Sarita Rahmawati, M.Sc.

2. EKSTRAKSI ENZIM AMILASE • Amilase bekerja pada pati, glikogen dan turunan polisakarida dengan menghidrolisa ikatan  - 1,4 – dan /  - 1,6 - glikosidik • Enzim amilase dalam kecambah termasuk enzim endoselluler sehingga untuk mengekstraksi terlebih dahulu harus menghancurkan biji kecambah

3. Alfa Amilase ( -1,4 glukanglukanohidrolase, E.C. 3.2.1.1) • memecah pati secara acak dari tengah atau dari bagian dalam molekul, karena itu disebut endoamilase • Pemecahanoleh - amilase pada amilosaterdiri atas 2 tahap: • Tahapdegradasicepat yang menghasilkanmaltotriosa dan maltosaPemecahantahappertamainiditandaidenganpenurunanviskositas yang cepat dan hilangnyakemampuanpewarnaaniodinterhadapamilosa • Tahap degradasi lambat terhadap oligosakarida menghasilkan glukosa dan maltosa

4. Beta– Amilase (- 1,4- glukan malto hidrolase, EC. 3.2.1.2) • Enzim  amilase bekerja pada substrat dari gugus terminal non-reduktif, pada ikatan glikosidis kedua dari ujung tersebut. Pada substrat amilosa, bila aktivitasnya tinggi dapat menghidrolisis sempurna menghasilkan maltosa. Pada substrat amilopektin akan menghasilkan maltosa dan sisa dekstrin BM- tinggi.

5. Glukoamilase • Memecah pati dari luar dengan mengeluarkan unit-unit glukosa dari ujung nonreduksi polimer pati. Hasil reaksinya hanya glukosa, sehingga dapat dibedakan dengan  dan  amilase. Secara komersial diproduksi dari Aspergillus, Rhizopus. Glukoamilase dapat memecah ikatan -1,3 dan - 1,4. Dengan pengaruh enzim glukoamilase posisi glukosa  dapat diubah menjadi , pH optimum 4-5 suhu 50-60C.

6. Tujuan • Mengisolasi enzim amilase dari kecambah kacang hijau. • Bahan: • biji kering • biji direndam semalam ( 12 jam) • biji dikecambahkan (12 jam) • biji dikecambahkan 24 jam • biji dikecambahkan 48 jam • buffer asetat (0.1-0.5 M) pH 5.5 • pati 4 % • pati 1 % • iodin 1 % • glukosa anhidrat • reagen nelson • reagen arsenomolibdat

7. Alat: • Mortar • Kertas saring • sentrifuse • Karet hisap • Pipet volume 1 ml • Tabung reaksi • Rak tabung reaksi • waterbath • Spektrofotometer • kuvet • beker glass 250 ml

8. Hancurkan 5 g kecambah biji • tambahkan 5ml buffer asetat (0.1 – 0.5 M) pH 5.5; • biarkan selama  30 menit sambil kadangkala diaduk • Saring dengan kertas saring Whatman, filtratnya merupakan larutan enzim kasar. • Sentrifugasi 1500 rpm selama 30 menit. • Ambil supernatannya untuk uji aktivitas

9. PENGUJIAN KUALITATIF ENZIM AMILASE • Parameter umum yang digunakan untuk mempelajari aktivitas hidrolitik enzim amilase terhadap substrat patidiantaranya : • Penurunanviskositas • Kehilangankemampuanuntukmemberikanwarnabirudenganiodin

10. Bahan • Pati 4% (DE=15-20) sebagai substrat • Buffer asetat sebagai pelarut substrat • Larutan iodin 1% sebagai indikator reaksi • Ekstrak kasar amilase • Alat • Tabung reaksi • Pipet mikro

11. Substrat yang digunakan larutan pati 4% (DE= 15-20) dengan pelarutnya buffer asetat pH 5.5. • 1 ml substrat • ditambah larutan iodin 1% • tambahkan dengan 0.5 ml larutan enzim. • Amati perubahan warna biru dari pati setelah ditambah larutan iodin 1%. • Inkubasi pada suhu kamar dengan pengamatan setiap 10 menit, selama 60 menit.