Directeur du laboratoire : M. Philippe MORA Responsable de stage : M. Philippe MORA

1. Olivier SAULNIER - BTS Biotechnologies Lycée Pierre-Gilles de Gennes / E.N.C.P.B Année 2011-2012 • Directeur du laboratoire : M. Philippe MORA • Responsable de stage : M. Philippe MORA • Encadrants : M. Marien HAVÉ et M. Ruben PUGA-FREITAS

2. Abstract Université Paris-Est Créteil (UPEC) : - 1971 - 32 000 students - 31 laboratories Unit 7618 BIOEMCO : Biogeochemistry and ecology of continental environments - 180 workers - 5 french and 8 international sites - 5 research teams IBIOS Team: Biological interactions into the soil

3. Abstract • Triticumaestivum : one of the mostcultivatedcerealworldwide • Pathogenicfungus(Gaeumannomycesgraminis) => Take-all (rootdisease) • important yield losses • Earthworm (Aporrectodeacaliginosa) = Biocontrol agent • reduce the impact of Take-all Studied the genes expression in Triticumaestivum Reverse transcription, quantitative PCR and cloning

4. Plan de la présentation • Le laboratoire et l’équipe • Le contexte • Transcription inverse des ARNm en ADNc • Amplification des ADNc par PCR • Clonage des produits de PCR • Analyse de l’expression de gènes par PCR quantitative • Conclusion

5. 1) Le Laboratoire et l ’équipe • BIOEMCO UMR 7618 : BIOgéochimie et Écologie des Milieux COntinentaux 7 tutelles AgroParisTech Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) ÉcoleNormaleSupérieure (ENS) Institut Scientifique de Recherche Agronomique(INRA) Institut de Recherche pour le Développement (IRD) Université Paris-Est Créteil (UPEC) Université Pierre et Marie Curie (UPMC) Thématiques : - analyse et modélisation des systèmes écologiques - impact des changements globaux sur les systèmes écologiques • IBIOS Plantes 2 sites (Bondy – IRD/ Créteil – UPEC) Plantes Macro-organismes Micro-organismes

6. 2) Le contexte • La maladie Piétin-échaudage (« Take-all ») Pathogène (Gaeumannomycesgraminis) Céréales (Triticumaestivum) Moyens de luttes Nécrosesracinaires Ver de terre(Aporrectodeacaliginosa)

7. 2) Le contexte • Le projet Objectif : Étude de l’expression de gènes afin d’identifier les voies métaboliques impliquées dans la réponse de la plante : - au pathogène - au ver - à l’interaction entre le pathogène et le ver

8. Triticumaestivum Extraction d’ARN ARN totaux Transcription inverse (oligodT) Analyse transcriptomique ADNc PCR Affymétrix (analyse globale) Validation Clonage Analyse en qPCR SYBR Green (analyse fine) Séquençage Banque d’ADNc Conservation Vérification

9. 3) Transcription inverse des ARNm en ADNc Rétrotranscription universelle Procédé : • Amorce oligodT • Transcriptase inverse à activité ADN polymérase (ARN dépendante) • et exoribonucléase H (RNase H) Principe :

10. 4) Amplification des ADNc par PCR gVPE : cystéine protéase impliquée dans la réponse d’hypersensibilité (HR) Profil attendu Profil obtenu Résultats : Électrophorèse sur gel d’agarose M 100 gVPE gVPE H2O M 100 - 157 - 200 - 100

11. 5) Clonage des produits de PCR • Ligature dans le vecteur pGEM-T Easy Objectif: Multiplier et conserver un fragment d’intérêt dans un micro-organisme Procédé : « TA cloning » pGEM-T Easy (3015 pb) + ligase T T

12. 5) Clonage des produits de PCR • Transformation et sélection des clones recombinés • Bactéries LacZΔM15 et compétentes (CaCl2) • Choc thermique (4°C => 42°C) • Culture toute la nuit sur milieu LB + Ampicilline + IPTG + X-Gal Système blanc/bleu

13. Non transformée Milieu LB + Ampicilline + IPTG + X-Gal Système blanc/bleu AmpR AmpR LacZα LacZα Fragment d’intérêt β-Galactosidase β-Galactosidase Transformée Transformée recombinante X-Gal X + Galactose X-Gal X + Galactose Ampicilline

14. 5) Clonage des produits de PCR • PCR sur colonie • PCR sur colonie : amorces SP6/T7 (taille de la cible + 150pb) Profil attendu Profil obtenu M 100 gVPE Résultats : Électrophorèse sur gel d’agarose gVPE 1 gVPE 2 gVPE 3 H2O M 100 gVPE 1 gVPE 2 gVPE 3 M100 H2O - 307 (157+150) - 300

15. 5) Clonage des produits de PCR • Purification d’ADN plasmidique et séquençage Wizard® Plus SV Minipreps DNA purification system (Promega) • Purification d’ADN plasmidique: - lyse alcaline • - purification par adsorption (silice) • Séquençage : GenoScreen (Lille) • 99% d’identité

16. 6) Analyse de l’expression de gènes par PCR quantitative Objectif : Niveau d’expression d’un gène dans une condition donnée par rapport à la condition témoin Procédé : PCR quantitative - SYBR Green PCR classique (30 cycles) n(vert) > n (bleu) PCR en temps réel n (bleu) > n(vert) Seuil de détection Ct (bleu) Ct (vert) Ct : cycle seuil Quantification plus précise

17. 6) Analyse de l’expression de gènes par PCR quantitative • Analyse de la spécificité des couples d’amorces 1 amplicon 1 Tm (longueur et composition) Courbe de fusion : - dénaturation (95°C) - hybridation (TH) - dénaturation progressive (+0,1°C/sec) lecture continue Dérivé première 1 seul amplicon = 1 pic unique Couple d’amorces spécifiques

18. 6) Analyse de l’expression de gènes par PCR quantitative • Détermination du gène de référence Gènes de références: Résultats: geNorm (indice de la stabilité de l’expression)

19. 6) Analyse de l’expression de gènes par PCR quantitative • Résultats ΔCt = Ct (témoin) – Ct(traitement)

20. Conclusion Travail réalisé : - détermination d’un gène de référence - constitution d’une banque d’ADNc(30 clones) - validation de l’expression de 3 gènes par qPCR Perspectives : - étudier l’expression d’au moins 7 autres gènes - identifier et comprendre les voies métaboliques impliquées - isoler des protéines impliquées dans ces voies afin de les comprendre • Conclusion personnelle • Remerciement : - M. Philippe MORA • - M. HAVÉ Marien • - M. PUGA-FREITAS Ruben • - Mme REPELLIN Anne Merci à vous tous pour votre attention

22. 6) Analyse de l’expression de gènes par PCR quantitative • Évaluation de l’efficacité de la PCR et résultats E+1 = 10(-1/pente) N=N0*(E+1)n