Esperto in gestione depuratori biologici e trattamento fanghi

1. Esperto in gestione depuratori biologici e trattamento fanghi Istituto Tecnico Industriale Stanislao Cannizzaro Catania ASPETTI MICROBIOLOGICI

2. Evoluzione della normativa • La legislazione italiana sulle acque reflue è stata scarsa e confusa fino al 1976, anno in cui è stata approvata e pubblicata la Legge 319/76, meglio conosciuta come "Legge Merli". • Vengono indicate le determinazioni di ordine chimico, chimico-fisico e batteriologico da seguire, gli standard da applicare, nonché le metodiche e le modalità tecniche di prelievo e la frequenza dei campionamenti • Vengono indicate le norme tecniche generali per la regolamentazione dell’istallazione e dell’esercizio degli impianti di acquedotto e di depurazione

3. Evoluzione della normativa • D.P.R. 24 maggio 1988, n. 236 “Attuazione della direttiva CEE n. 80/778 concernente la qualità delle acque destinate al consumo umano, ai sensi dell’art. 15 della legge 16.4.1987 n. 183” (15). • In 22 articoli vengono stabiliti i requisiti di qualità delle acque destinate al consumo umano al fine di tutelare la salute pubblica e migliorare le condizioni di vita e vengono introdotte le misure finalizzate a garantire la difesa delle risorse idriche. • Definisce oltre 60 parametri per classificare le acque destinate al consumo umano.

4. Elenco dei parametri previsti dal D.P.R. 236/88 per definire i requisiti di qualita’ delle acque destinate al consumo umano

5. Sostanze indesiderabili

6. Sostanze tossiche

7. Parametri microbiologici

8. Modelli e frequenze delle analisi delle acque destinate al consumo umano

10. I concetti più importanti introdotti dalla legge sono: • concentrazione massima ammissibile (CMA) rappresenta un livello di rischio a cui l’uomo non può essere sottoposto nemmeno per un breve periodo di tempo. Pertanto tale valore non deve essere superato in alcun caso; • valore guida (VG) rappresenta il livello di sicurezza che dovrebbe essere mantenuto costantemente, ossia è il valore ottimale al quale deve tendere l’Ente preposto alla potabilizzazione.

11. D.leg. 11 maggio 1999, n. 152 “Disposizioni sulla tutela delle acque dall’inquinamento e recepimento della Direttiva 91/271/CEE concernente il trattamento delle acque reflue urbane della Direttiva 91/676/CEE relativa alla protezione delle acque dall’inquinamento provocato dai nitrati provenienti da fonti agricole”. Sostituisce la Legge Merli e detta le disposizioni correttive del precedente decreto in materia di tutela delle acque dall’inquinamento

12. Obiettivi: a) prevenire e ridurre l’inquinamento e attuare il risanamento dei corpi idrici inquinati; b) conseguire il miglioramento dello stato delle acque ed adeguate protezioni di quelle destinate a particolari usi; c) perseguire usi sostenibili e durevoli delle risorse idriche, con priorità per quelle potabili; d) mantenere la capacità naturale di autodepurazione dei corpi idrici nonché la capacità di sostenere comunità animali e vegetali ampie e ben diversificate.

13. La normativa si sviluppa con la seguente articolazione: • obiettivi di qualità • tutela dei corpi idrici e disciplina degli scarichi • strumenti di tutela • sanzioni • monitoraggio e classificazione delle acque in funzione degli obiettivi di qualità ambientale • classificazione dei corpi idrici a specifica destinazione

14. il D.Lgs. 152/99 classifica le acque superficiali in tre categorie di qualità decrescenti (A1, A2, A3), in base a determinati valori-limite fissati per 46 parametri relativi a caratteristiche fisiche, chimiche e microbiologiche (art. 7). Prevede, quindi, in relazione alla categoria di appartenenza, specifici trattamenti di potabilizzazione di complessità crescente. • CATEGORIA A1 = trattamento fisico semplice e disinfezione; • CATEGORIA A2 = trattamento fisico e chimico normale e disinfezione; • CATEGORIA A3 = trattamento fisico e chimico spinto, affinazione e disinfezione

15. Parametri igienico-sanitari Parametro A1 A2 A3 Coliformi totali ufc/100ml 50 5000 50.000 Coliformi fecali ufc/100ml 20 2000 20.000 Streptococchi fecali ufc/100ml 20 1000 10.000 Salmonelle Assenza in 5lt Assenza in 1lt -

16. Decreto 12 Giugno 2003, n. 185 “Regolamento recante norme tecniche per il riutilizzo delle acque reflue in attuazione dell'articolo 26, comma 2, del decreto legislativo 11 maggio 1999, n. 152” Il regolamento stabilisce le norme tecniche per il riutilizzo delle acque reflue domestiche, urbane ed industriali attraverso la regolamentazione delle destinazioni d'uso e dei relativi requisiti di qualità, ai fini della tutela qualitativa e quantitativa delle risorse idriche, limitando il prelievo delle acque superficiali e sotterranee, riducendo l'impatto degli scarichi sui corpi idrici recettori e favorendo il risparmio idrico mediante l'utilizzo multiplo delle acque reflue.

17. Art. 3. Destinazioni d'uso ammissibili 1. Le destinazioni d'uso ammissibili delle acque reflue recuperate sono le seguenti: a) irriguo: per l'irrigazione di colture destinate sia alla produzione di alimenti per il consumo umano ed animale sia a fini non alimentari, nonchè per l'irrigazione di aree destinate al verde o ad attività ricreative o sportive; b) civile: per il lavaggio delle strade nei centri urbani; per l'alimentazione dei sistemi di riscaldamento o raffreddamento; per l'alimentazione di reti duali di adduzione, separate da quelle delle acque potabili, con esclusione dell'utilizzazione diretta di tale acqua negli edifici a uso civile, ad eccezione degli impianti di scarico nei servizi igienici; c) industriale: come acqua antincendio, di processo, di lavaggio e per i cicli termici dei processi industriali, con l'esclusione degli usi che comportano un contatto tra le acque reflue recuperate e gli alimenti o i prodotti farmaceutici e cosmetici.

18. Art. 7. Controllo e monitoraggio degli impianti di recupero 1. L'impianto di recupero delle acque reflue è soggetto al controllo da parte dell'autorità competente, ai sensi dell'articolo 49 del decreto legislativo n. 152 del 1999, per la verifica del rispetto delle prescrizioni contenutenell'autorizzazione di cui all'articolo 6. Il controllo, su disposizione dell'autorità competente e sulla base del programma di controllo di cui all'articolo 49, comma 1, del decreto legislativo n. 152 del 1999, può essere effettuato dal titolare dell'impianto di recupero. 2. Il titolare dell'impianto di recupero deve, in ogni caso, assicurare un sufficiente numero di autocontrolli all'uscita dell'impianto di recupero, comunque non inferiore a quello previsto dalla normativa regionale in rapporto alle specifiche utilizzazioni. I risultati delle analisi devono essere messi a disposizione delle autorità di controllo.

19. Art. 11. Monitoraggio delle attività di riutilizzo 1. Il titolare della rete di distribuzione effettua il monitoraggio ai fini della verifica dei parametri chimici e microbiologici delle acque reflue recuperate che vengono distribuite e degli effetti ambientali, agronomici e pedologici del riutilizzo. L'autorità sanitaria, nell'esercizio delle attività di prevenzione di propria competenza e in relazione a quanto stabilito dall'articolo 4, comma 2, valuta gli eventuali effetti igienico-sanitari connessi all'impiego delle acque reflue recuperate. 2. I risultati del monitoraggio sono trasmessi alla regione con cadenza annuale.

20. Requisiti di qualità delle acque reflue recuperate destinate ad uso agricolo

21. APPLICAZIONI DI ACQUE REFLUE RIGENERATE Lavaggio strade e auto, irrigazioni campi di golf, realizzazione di compost, arricchimento terreni “poveri”, utilizzo nei processi industriali,……. Impieghi Ambientali:riduzione del carico inquinante sversato nei corpi idrici superficiali Vantaggi Agronomici: nuova fonte di approvvigionamento idrico per l’irrigazione

22. L’ACQUA E LE MALATTIE INFETTIVE L'acqua rappresenta il mezzo di diffusione di tutte quelle malattie infettive dette a circuito oro-fecale, cioè malattie dovute all'ingestione di acqua venuta a contatto con deiezioni di animali a sangue caldo, tra questi l'Uomo. Tra le malattie infettive conosciute molte sono determinate da organismi parassiti che trovano nell'intestino la loro preferenziale localizzazione. Tra gli organismi patogeni trasmessi per via idrica vi sono i batteri, virus e protozoi.

23. QUALITÀ IGIENICO-SANITARIA DELLE ACQUE Analizzare un'acqua dal punto di vista microbiologico significa valutare qualitativamente e quantitativamente l’eventuale presenza in essa di microrganismi patogeni di natura batterica e/o virale. Tuttavia, se da una parte il loro rilevamento in un'acqua é indice della loro presenza, dall'altra non si può dire che un risultato negativo deponga sicuramente per la loro assenza.

24. CLASSIFICAZIONE DEI MICRORGANISMI Batteri Superegno: PROCARIOTI organismi sprovvisti di membrana nucleare Cianobatteri Alghe Funghi Superegno: EUCARIOTI organismi provvisti di membrana nucleare Lieviti e muffe Protozoi Piante Animali VIRUS

25. Salmonella Typhi Staphylococcus aureus BATTERI PATOGENI IN AMBIENTE IDRICO ha una resistenza variabile in rapporto a fattori diversi (temperatura, umidità, presenza di sostanze organiche, ecc.) in particolare nell’acqua potabile può resistere da 7 a 13 giorni Vibrio cholerae sopravvive fino a 40 giorni la presenza può essere dovuta ad infiltrazioni di liquami per dissesti nella rete di distribuzione, ad inquinamento della sorgente, a cattivo funzionamento degli impianti di potabilizzazione è più resistente dei coliformi fecali nell’ambiente esterno resiste all’azione del cloro

26. MORFOLOGIA BATTERICA (COCCHI) COCCHI SINGOLI SARCINE DIPLOCOCCHI STREPTOCOCCHI TETRADI STAFILOCOCCHI

27. MORFOLOGIA BATTERICA (BACILLI) BACILLI COCCOBACILLI DIPLOBACILLI STREPTOBACILLI

28. MORFOLOGIA BATTERICA (SPIRALE) VIBRIONI (es. V. cholerae) SPIRILLI SPIROCHETE

29. MORFOLOGIA BATTERICA ESEMPI STREPTOCOCCHI STAFILOCOCCHI COCCHI E. COLI S. TYPHI BACILLI TREPONEMA PALLIDUM V. CHOLERAE BORRELIA BURGDOFERI SPIRILLI

30. MORFOLOGIA BATTERICA

31. MORFOLOGIA BATTERICA STAFILOCOCCHI STREPTOCOCCHI

32. Peptidoglicano Peptidoglicano Membrana citoplasmatica Membrana citoplasmatica Periplasma Membrana esterna PRINCIPALI DIFFERENZE NEGLI INVOLUCRI ESTERNI DEI BATTERI GRAM– E GRAM +

33. MOLTIPLICAZIONE • Cellula madre 2 cellule figlie • Separazione completa • Separazione incompleta (catene, grappoli, palizzate, ecc.) SCISSIONE GEMMAZIONE Produzione di protuberanze che si staccano dalla cellula madre Spore: forma di resistenza (a numerosi agenti fisici e chimici) caratterizzata dall’assenza di ogni attività metabolica (es. Clostridium tetani, C. botulinum). In condizioni favorevoli: GERMINAZIONE (passaggio alla forma vegetativa). SPORIFICAZIONE

34. D.P.R. 236/88 INDICATORI Valore guida (VG)* Conc. massima ammissibile (CMA)** OSSERVAZIONI Coliformi totali - 0 Non più del 5% dei campioni esaminati nell’arco dell’anno e non più di 2 campioni consecutivi possono eccedere tale limite; comunque mai il contenuto di C. totali può essere superiore a 5/100ml. Coliformi fecali - 0 Enterococchi - 0 Clostridi solfito-riduttori - 0 Conta batterica a 36°C 10 u.f.c. - Ogni superamento di tali valori che persiste durante i prelievi successivi richiede indagini e accertamenti appropriati Conta batterica a 22°C 100 u.f.c. - Per le acque disinfettate i valori all’uscita degli impianti di disinfezione devono essere nettamente inferiori ai valori riscontrati prima del trattamento * il valore di sicurezza al cui raggiungimento deve tendere l’ente preposto alla potabilizzazione ** la concentrazione che non può essere superata in alcun caso rappresentando un livello di rischio per l’uomo

35. INDICATORI SIGNIFICATO Carica batterica Indica lo stato microbico generale dell’acqua Coliformi totali Non possono essere considerati indicatori di contaminazione di sicura origine fecale; utili come indicatori dell’integrità delle reti idriche Coliformi fecali Rappresentano dei buoni indicatori di contaminazione fecale in atto e indicano una contaminazione in prevalenza di origine umana Enterococchi Rappresentano dei buoni indicatori di contaminazione fecale recente e dell’efficienza dei trattamenti di potabilizzazione delle acque; indicano una contaminazione in prevalenza di origine animale Clostridi La presenza di spore e/o di forme vegetative può fornire indicazione di inquinamento remoto o intermittente e risulta quindi utile, accanto ai classici indicatori di contaminazione fecale, ai fini del controllo dello stato igienico-sanitario delle acque potabili e delle condizioni delle reti idriche

36. COLIFORMI • Microorganismi appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceae • Bacilli Gram negativi, di forma bastoncellare • Fermentano il lattosio con produzione di gas e acido • Rappresentano un gruppo eterogeneo a cui appartengono le specie dei generi Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella • Si sviluppano a temperature tra 25-45°C (optimum a 37°C)

37. Escherichia coli • Microorganismo appartenente alla famiglia delle Enterobacteriaceae • Bacillo Gram negativo, di forma bastoncellare • E’ un ospite normale dell’organismo umano • Si differenzia dagli altri coliformi in quanto fermenta il lattosio a 44°C • Produce indolo da triptofano (Reazione di Kovacs) • Si può trovare nel latte, nei formaggi, nel pollame • La concentrazione infettante minima è 106-108 ufc/ml • Esistono ceppi (O157:H7) responsabili di gravi epidemie

38. STREPTOCOCCHI FECALI • Appartengono al gruppo D della classificazione di Lancefield • Cocchi Gram positivi • Appartengono alla flora batterica degli animali a sangue caldo • Rappresentano un gruppo eterogeneo a cui appartengono E. faecalis subsp. faecalis, E. faecalis subsp. faecium, E. faecalis subsp. liquefacens, S. bovis, S. equinus, ecc. • E. faecalis ed E. faecium sono le specie più frequentemente isolate dal tratto gastrointestinale e quindi la loro presenza nell’ambiente è correlabile con certezza a contaminazione fecale • Gli Enterococchi si identificano come quelle specie incluse nel nuovo genere Enterococcus

39. Salmonelle • Bacilli gram negativi, anaerobi facoltativi • Appartengono alla famiglia delle Enterobacteriaceae • Il genere comprende oltre 2000 sierotipi • Fermentano il glucosio • Producono idrogeno solforato • La temperatura ottimale di crescita è 35-37°C • Non resistono al calore: 75°C per 10’ La loro presenza nell’ambiente indica l’esistenza di una contaminazione fecale primaria (immissione diretta di acqua di scarico) o secondaria (dilavamento di suoli) Il trattamento di disinfezione delle acque ne riduce le concentrazioni (99% rimozione)

40. Listeria monocytogenes • Batterio Gram positivo, aerobio • Mobile per mezzo di flagelli • Sono ubiquitarie, possono trovarsi nell’acqua, nell’uomo, negli animali e in altre sorgenti ambientali • Non produce spore • Crescono anche a basse temperature Sono in grado di produrre tossine, ma la patogenicità è dovuta alla capacità di moltiplicarsi nell’organismo Pericolosa per le donne in gravidanza e per anziani

41. Pseudomonas aeruginosa • Bacillo gram negativo • Diffuso nel suolo, nell’acqua, nell’aria ma anche nelle feci ,nei liquami e negli ambienti umidi • E’ considerato indicatore degli scarichi (essendo più abbondante nei liquami che nelle feci) • La presenza di questo microrganismo non è legata a quella dei più usuali indicatori di inquinamento fecale • Ha la capacità di proliferare in mezzi minimi • Il fattore che determina il potere patogeno è la sua resistenza ad un gran numero di antibiotici, antisettici e disinfettanti • Si sviluppa anche in regime di frigo-conservazione • Presente nelle acque confezionate indicano scadenti condizioni igieniche dell’ambiente di imbottigliamento • La sua presenza è indice di inefficaci trattamenti di potabilizzazione

42. Aeromonas hydrophila • Il genere Aeromonas comprende 3 specie mobili correlate a gastroenteriti: Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae e Aeromonas sobria. Il meccanismo patogenetico non è ancora del tutto chiarito. • Le matrici alimentari più frequentemente associate a casi di gastroenterite da Aeromonas spp. sono acqua, vegetali conservati a lungo in frigorifero comprese le insalate pronte al consumo (IV gamma), crostacei e molluschi, gelati, insalate con maionese, piatti freddi • Batterio gram negativo, anaerobio facoltativo • L'intervallo di temperatura per la crescita di Aeromonas hydrophila è compreso tra 4 e 42°C con optimum a 28°C • I valori di pH sono compresi tra 6.5 e 7.2 con tolleranza da 4.5 a 8.8 • Aeromonas hydrophila si moltiplica anche in atmosfera modificata (azoto, argon,ecc.) o sottovuoto • Si sviluppa anche in regime di frigo-conservazione

43. ELMINTI • Sono animali microscopici, invertebrati senza appendici, con corpo cilindrico, arrotondato, fusiforme, posteriormente allungato in una coda. • Il ciclo vitale comprende lo stadio di uovo, quattro stadi larvali ed uno adulto • Hanno diffusione cosmopolita, vivono nelle acque dolci, nel mare e nel suolo • Resistenza ai sistemi di clorazione e capacità di entrare nei sistemi di distribuzione • Nelle acque reflue vengono ricercate le uova vitali mediante metodo della sedimentazione, flottazione e osservazione con vetrino di McMaster

44. Isolamento di microrganismi responsabili di malattie infettive • RACCOLTA DEI CAMPIONE: • Il campione deve provenire dalla zona dove è in atto l’infezione • Si devono stabilire i periodi ottimali per la raccolta del campione onde avere maggiore possibilità di isolamento dei microrganismi patogeni • Si deve prelevare una quantità di materiale sufficiente per permettere l’esecuzione delle tecniche di coltura richieste • Si devono impiegare dispositivi di raccolta, contenitori per campioni e terreni di coltura idonei onde garantire un isolamento ottimale dei microrganismi

45. 2. TRASPORTO DEL CAMPIONE I campioni devono essere inviati in laboratorio il più presto possibile (max 2 ore) ed è necessario evitare condizioni ambientali sfavorevoli (l’esposizione al caldo o al freddo eccessivi o l’essiccamento) Enterococchi 12 (18) Batteri e spore di Clostridi solfito-riduttori 48 (72) Batteriofagi 48 (72) Salmonella e altre Enterobatteriacee 12 (18) Enterovirus 48 (72) Cisti/oocisti di Giardia/Cryptosporidium 48 (72) Amoebae 48 (72) Staphylococcus 8 (12) Pseudomonas aeruginosa 8 (12) Legionella 48 (72) Cianobatteri 48 (72) Campylobacter 6 (8) Uova di Elminti (a pH 2,0) 48 (72)

46. 3. ANALISI MICROBIOLOGICA ATTRAVERSO L’IMPIEGO DI TERRENI DI COLTURA liquido • Semina su terreno in superficie solido per inclusione • Metodo MPN: semina di quantità scalari di campione • Filtrazione su membrana

47. ESAME MORFOLOGICO …..Consiste Nell’isolamento dei batteri presenti in un materiale impiegando in terreni più adatti allo sviluppo della specie di cui si desidera accertare la presenza Si usano dei terreni solidi e il materiale viene seminato per strisciamento sulla superficie dell’area di semina, ciò consente di ottenere delle colonie sufficientemente distanziate per procedere poi alla loro identificazione Dalle colture isolanti, soprattutto se eseguite su terreni selettivi ed indicatori si ottengono alcune informazioni che possono orientare e sul numero di specie batteriche presenti e sulla loro identificazione Molto utili sono le caratteristiche cromatiche e l’aspetto delle colonie

48. IDENTIFICAZIONE MORFOLOGICA • Terreni selettivi ad opportune temperature di incubazione • Colorazione di Gram: osservazione al microscopio Test di Kovacs • Test rapidi Test con KOH al 3%

49. Metodi analitici Metodo delle diluizioni seriali

50. Metodo MPN (Most Probable Number)