Áramlási citometria az orvosi diagnosztikában és gyógyszerkutatásban Dr. Milosevits Gergely

1. Áramlási citometria az orvosi diagnosztikában és gyógyszerkutatásbanDr. Milosevits Gergely

2. Előadás vázlat • Definíció • Történeti áttekintés • A műszer alapvető felépítése • Mérhető paraméterek • Alkalmazási területek • Orvosi diagnosztika • Mérések értékelése • Ipari felhasználás • Kutatás és gyógyszerfejlesztés

3. Mit jelent? • Az áramlási citometria egy módszer,mely során… • folyadékban szuszpendált sejtek / részecskék áramolnak egyesével egy fényforrás előtt, • ami alapján azok fizikai és / vagy kémiai tulajdonságaira következtethetünk a generált jelek detektálásával és elemzésével.

4. Az áramlási „partikulometria” kezdetei: 50-es évek • Elmqvist / Sweet tintasugaras nyomtató: tintacseppek áramoltatása, számlálása • Wallace H. Coulter (1913-1998) Coulter számláló: sejtek analízise áramló folyadékban „Vérkép”-elemzés

5. Az citometria fejlődése: • Becton & Dickinson: FACScan • Herzenberg : • - szorter funkcióval ellátott flow cytometer (1975) • - FACS = Fluorescence Activated Cell Sorter

6. Legújabb típusú készülékek: • Több lézer, detektálási hullámhosszsáv • Hordozható • „Megfizethető” ár: 12m Ft • BD Accuri BD FACSVerse • Összes elérhető laser-t tartalmazza • Teljesen automatizált működés • 96 well plate mintaadagoló

7. Alapvető felépítés • Áramlási kör: • Tartályok • Csőrendszer • Filterek • Áramló köpenyfolyadék: PBS • Fényforrás: • Argon (488nm) laser / He- Ne (635nm) laser / He- Cd (325nm) laser/ UV • Detektorrendszer • Analóg-Digitális átalakító • Számítógép + Software

8. Mérhető paraméterek • Fluoreszcencia: • = laser által gerjesztett fény, • melyet fluoreszcens festékek által jelzett részecskék emittálnak • Side scatter (SSC) • ≈ partikulum granularitás • Forward scatter (FSC) • ≈ partikulum méret

9. Detektálási lehetőségek • Sejt / részecske: natív mérés • FSC, SSC • Felszíni antigének • Szekunder AT - Fluoreszcens festék • Antitestek, citokinek • Adszorbens gyöngy + szekunder AT- Fluoreszcens festék

10. Fluoreszcens festékek

11. HÁTRÁNYOK Karbantarás: körülményes, drága Fluoreszcens festékek, AT-k drágák (pl. FITC kötött AT: 100-150e Ft / ml) Méretkorlát: 0,3 és 150 μm Miért jó / nem jó? ELŐNYÖK • Sok részecske gyors analizálása • Sejt sub-típusok kvantitatív meghatározása • Natív mérés: olcsó • Egyszerre több paraméter mérése

12. NEM MÉRHETŐ 300nm alatti vagy 150 μm feletti részecskék Pontos méret, szerkezeti felépítés Morfológia Mire jó / nem jó? MÉRHETŐ • Sejtek / 300nm feletti részecskék • Hozzávetőleges méret, granuláltság • Sejtfelszíni marker, DNS tartalom, ionáramlás, antitestek, citokinek (FL szek. AT és adszorbens gyöngyök közvetítésével)

13. Gógyszerkutatás Immunogenitás vizsgálata Gyógyszerhatás felmérése Szerkezeti analízis Lehetséges alkalmazási terültek Orvosi diagnosztika • Infektológia • Immunológia / Allergológia • Hematológia • Onkológia

14. Elérhető rutin-laboratóriumi vizsgálatok • Vérkép • CD4/CD8 sejtarány • Th1/Th2 arány • NK funkció, arány • HLA-B27 meghatározás • Immunglobulin szint meghatározás • DNS tartalom és sejtproliferáció vizsgálata • Bazofil aktivációs teszt • Leukémia és limfóma „panel”-ek

15. DD.: Infektologia • Teljes vérkép meghatározása • Kalibrált automata: • pl. Abbot Cell-Dyn 3500 • Multi-Angle Polarized Scatter Separation • 0° : sejtméret • 10° : sejtszerkezet és komplexitás • 90° polarizált: nukleáris lebenyezettség • 90° depolarizált : eosinophilek differenciálása

16. DD.: Infektologia Fehérvérsejtszám: Fiziológiás: • Neu: 2000-7500/ µL • Ly: 1500-4000/µL Bakeriális inf: • Neu: ↑↑↑ • Ly: - Virális infekció: • Neu: - • Ly: ↑↑↑

17. Immunologia T-sejt meghatározás

18. Immunologia T-sejt meghatározás CD4 CD8 CD3 CD3

19. Immunologia T-sejt meghatározás: Citotoxikus T T helper CD8 CD4 CD3 CD3

20. Immunologia • Basophil aktivációs teszt: • Aktivációs marker: CD63 • pl. krónikus idiopátiás urticaria • diagnózisa

21. Onkologia • DNS tartalom analízis • Elmélet: • Tumoros sejtek DNS tartalma nagyobb • Nagyobb S és G2/M arány • Gyakorlat: • Sejt permeablitiásának fokozása • DNS tartalom festése: propidium jodid – fokozza a fluoreszcenciát!

22. Haematologia • Leukaemiák és limfómák DD. Sejtfelszíni markerek alapján • Utánkövetés: Minimális Reziduális Betegség (MRD) • Retikulocytaszám meghatározás: Anaemia DD.

23. ALL • VÉRKÉP: VVT ↓, THR ↓ , FVS (↑/−/↓) • ( + ↑ LDH, karbamid, sülly.; periférián blasztok, máj-, vesefunkc. eltérések) • Osztályozás.: Morfológia + genetika + • immunologia! • B-sejt: CD 10, 19, 20, 22 • T-sejt: CD 2, 3, 5 • Differenciálatlan: TdT; (HLA-DR; CD34) • Gyors fenotipizálás citometriával!

24. ALL B-sejtes T-sejtes Korai T: + : TdT; CD7; cyCD3 - : CD1 Átmeneti- T: + : TdT; CD1, -7 érett-T: + : SCD3; CD7; (TdT) • Pre-pre-B: • + :TdT; CD19, -34; HLA-DR • Pre-B: • + : TdT; CD19; cyIgM; (CD10) • Burkitt-ALL: • + : CD19; SIgM; κ/λ; (CD10) • - : CD34; HLA-DR • Differenciálatlan: • +: TdT; (HLA-DR; CD34)

25. AML • VÉRKÉP:VVT ↓, THR ↓ , FVS (↑/−/↓) • Osztályozás.: Morfológia + genetika + • immunologia! • Myelocyta markerek: CD13, -33; cyMPO • Monocyta markerek (M4,M5): CD14 • Thrombocyta markerek (M7): CD41, -42, -61 • Citometria! 2006-os Bethesda beosztás: CD7, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD16, CD33, CD34, CD45, CD56, CD117, HLA Dr

26. AML • CD45 vs. SSC kapuzás: felismerhetők a myeloblastok

27. M0 / M1 / M2 AML (Myelocyta)

28. M3 AML (promyelocyta)

29. M4 / M5 AML (monocyta)

30. M6 AML (erythrocyta)

31. M7 AML (megakaryocyta) CD 42b CD 41

32. Ipari felhasználás • Ivóvízben, fürdővízben baktériumok gyors kimutatása • Kalibrált automaták, gyors és olcsó analizálás • Nagy mintaszám ellenőrzése • Borászatban megfelelő élesztőkoncentráció mérése • Tenyészállat nemzőképességének felmérése • ivarsejtek számlálása • DNS festés segítségével a viabilitás felmérése

33. Alkalmazás a kutatásban, gyógyszerfejlesztésben • Intracelluláris enzimek és ionok koncentrációjának mérése • Membránpotenciál mérése • DNS tartalom, sejtproliferáció, apoptózis vizsgálata • MDR mechanizmusának vizsgálata • Immunogenitás • Aggregációvizsgálat • In vivo és képalkotóval kombinált vizsgálatok

34. Ionkoncentrációk mérése • Indikátor alkalmazása: • sejtbe áramlik → hidrolizálódik → • → nem jut át a sejtmembránon • → intracellulárisan felhalmozódik • SBFI – Na+ • PBFI – K+ • FURA-2, INDO-1, Fluo-3 – Ca2+ • BCECF – pH

35. Membránpotenciál mérése • Oxanol • Membránpotenciálnak megfelelően oszlik meg a membrán két oldalán • Depolarizáció hatására nő az intracelluláris oxanol mennyisége → fluoreszcencia fokozódik

36. Gyógyszerkutatás:MDR vizsgálata • Calcein • festék, amely intracellulárisan felhalmozódik • MDR pumpák a sejtből eltávolítják • Intracelluláris jelenlétével arányosan változik a sejt fluoreszcenciája

37. GyógyszerkutatásApoptózis vizsgálata • Plazmamembrán változások: • ANNEXIN V szintje emelkedik • FITC konjugálva mérhető • DNS fragmentáció • Propidium jodidos festés: • korai, késői apoptotikus sejtek és nekrotikus törmelék elkülönítése

38. Immunogenitás vizsgálata • Poliklonális és specifikus monoklonális antitestek vizsgálata • Kvantitatív meghatározás • IgA, IgE, IgM, IgG szintek mérése • Módszer: multi-bead array • Gyöngyökhöz kötött antitesek vizsgálata szekunder, fluoreszcens antitestekkel

39. Nanopartikulumok aggregációjának vizsgálata • Szupravezikuláris struktúrák vizsgálata liposzómális oldatokban • Szabad-gyógyszer koncentráció hatásainak vizsgálata a liposzómális-gyógyszer stabilitására és aggregálódására

40. Nanopartikulumok aggregációjának vizsgálata • PBS puffer (A), lejárat előtti Caelyx (B), lejárat utáni Caelyx (C)

41. Nanopartikulumok aggregációjának vizsgálata • A: lejárat előtti Caelyx közvetlenül felbontás után • B: lejárat utáni Caelyx • C: lejárat előtti Caelyx nyitás után percekkel újra mérve

42. A jövő lehetőségei • ZÁRT RENDSZEREK: • Imaging flow cytometry • Morfológiai anamnézist is lehetővé tesz: az áramló részecskékről képfelvétel készül • NYÍLT RENDSZEREK: • LSC: Laser scanning cytometry • Tárgylemezen lévő sejtek analízise: morfológiai elemzés és fluoreszcencia rögzítése • In vivo citometria • Tumorsejtek intravasális nyomonkövetése

43. Összegzés • Az áramlási citometria alkalmas sok részecske gyors és többparaméteres kvalitatív és kvantitatív vizsgálatára • Alkalmazása széleskörben elterjedt, a mindennapi orvosi diagnosztikától, az alapkutatás számos területén át, az ipari felhasználásig. • Különböző igényeknek megfelelően számos műszer működik ezen az elven, ami a teljesen automatizált analízist is lehetővé teszi • Ez egy érdekes és hasznos módszer, amivel érdemes foglalkozni!

44. Köszönöm a figyelmet!