生化学合同講義（ 2009 年 6 月 3 日）

1. 生命科学研究科、山本和生 yamamot@m.tains.tohoku.ac.jp 生化学合同講義（2009年6月3日） 「突然変異生成の分子機構」 1) 突然変異をどのように把握するか 2) 突然変異とがん Fileのupload http://www.biology.tohoku.ac.jp/~kazuo/09seikagaku/

2. 突然変異(mutation) 塩基配列が変化する（広い意味での変化）。 　その結果表現型が変化する。 (表現型の変化が子孫（広い意味の子孫）に伝わる)。 表現型の変化しない塩基配列変化はヒトの場合0.1%の頻度で全員にある（polymorphism) 意義；進化（多様性）・がん・遺伝病 生物は適応的に変異が生じて進化したのではなくて，ランダムに生じた変異が淘汰されることによって進化した（非ラマルク説）。

3. 遺伝病は遺伝現象を担っているもの（遺伝子や染色体）の異常によって起こる病気遺伝病は遺伝現象を担っているもの（遺伝子や染色体）の異常によって起こる病気 もし異常が体細胞（手や肝臓などの細胞）に起きた場合，遺伝病にはなるが遺伝はしない。 もし生殖細胞（精子や卵子になる）に起きた場合，遺伝する可能性がある。 ヒトは全員，20〜30個の遺伝病をヘテロ接合体（T/t）の状態で持っている。多くは劣性なので発現（発病）しない。 遺伝と遺伝病 genetic disease（遺伝子病） inheritant disease（遺伝する病気）

4. 遺伝病とは 遺伝病は遺伝という現象を担っているものすなわち遺伝子や染色体の異常によって起こる病気を言う。 「遺伝病とは遺伝する病気」と言うわけではない。 　　伝わるとか伝わらないという概念とは違う。 親が正常でも突然変異によって起こる遺伝病もある。先天異常についていえば，病気の赤ちゃんの多くは，まったく正常な両親から生まれており，けっして特別な人がかかわるわけではない 「自分自身が遺伝病に罹患しているかもしれないし，遺伝病の子が生まれるかもしれない」というのが正しい理解。

5. 常染色体劣性遺伝病 健康保因者同士の結婚で，生まれる子供の４人に１人が病気になる

6. 両親とも保因者で，それぞれ1個は白丸，1個は黒丸を持っている場合，患者が生まれることがある。どちらから白あるいは黒が伝わるかで，4通りの組み合わせが出来る。白と白なら正常，白と黒は健康で保因者，黒と黒なら病気の子となる。すなわち，保因者同士のカップルからは，4人に1人の割合で病気の子供が生まれる。両親とも保因者で，それぞれ1個は白丸，1個は黒丸を持っている場合，患者が生まれることがある。どちらから白あるいは黒が伝わるかで，4通りの組み合わせが出来る。白と白なら正常，白と黒は健康で保因者，黒と黒なら病気の子となる。すなわち，保因者同士のカップルからは，4人に1人の割合で病気の子供が生まれる。 劣性遺伝病-1 算数の問題；ある劣性遺伝病の発生頻度が4万人に1人とする。保因者同士のカップルからは，4人に1人の割合で病気の子供が生まれる。保因者は何人に1人か？ 保因者をX人に一人とすると， (1/X)2 x (1/4) = 1/40000: この式より，X2 = 10000； X = 100 劣性遺伝病は1万人から10万人に一人の割合で起こるものが多い。平均して発生頻度が4万人に1人の病気の場合，患者すなわち黒丸二個の人は4万人に1人の割合で生まれるが，保因者すなわち黒丸1個の人がどれくらいいるかというと，答えは100人に1人である。4万人に1人と大変稀な病気であっても，保因者の頻度は二桁も高くなる。

7. Hardy-Weinberg の法則 A A a AA 野生型遺伝子(A)の頻度を p 変異遺伝子(a)の頻度を q (p + q = 1) とする。 健康保因者(Aa)の頻度について AA : Aa : aa = p2 : 2pq : q2 a Aa Aa aa ある遺伝病患者が40000人に一人とすると， aa（遺伝病）の頻度　q2 = 1/40000, q = 1/200 p = 1- q = 1-1/200 = 199/200 Aa（保因者）の頻度 = 2pq = 2 x 199/200 x 1/200 = 199/20000 = 99.5/10000 ≒ 1/100 パネットの方形 別の解き方；保因者の頻度をyとすると，保因者同士が結婚する確率はy2，その結婚から患者が生まれる確率は1/4、以上より，y2 x 1/4 = 1/40000。この式を解くと，y = 1/100

8. 劣性遺伝病-2 常染色体劣性遺伝病は先天代謝異常症を中心に約2000種類知られている。すべての疾患の頻度が明らかになっているわけではないが，保因者頻度を100人に1人程度とすると，2000 x 1/100 = 20となり，すべての人は常染色体劣性遺伝病の病的遺伝子を20個程度持っているということになる。「全てのヒトはみな保因者」である。 よく，劣性遺伝病の子供が生まれると，親は自分たちが保因者だったことを重く見て落ち込む人がいるが，それはたまたま病気の子供が生まれ，1個分の黒丸を持っていたことがわかっただけで，全ての人は，等しく20個の遺伝病を持っていることを忘れてはならない。保因者であることは，恥ずべきことではない。

9. Purines Pyrimidines Adenine Thymine Weak Guanine Cytosine Strong LargeSmall 塩基と大きさ

10. DNAの化学-1

11. DNAの化学-2

12. Uracil Thymine DNA, RNA, thymine, uracil 5 5 4 1 4 1 2 2 3 3 Ribose 2-Deoxyribose

13. 3 components to nucleotides: • -Purine(A & G) or pyrimidine(T & C) base • -Ribose (RNA) or 2-deoxyribose (DNA) sugar • -Phosphate • Base + sugar = Nucleoside • Base + sugar + phosphate = Nucleotide Nucleotide

14. DNAの方向性について

15. The 3’ C of one nucleotide is linked to the 5’ C of the next nucleotide in a phosphodiester linkage. Dinucleotideの構造 3’ 5’ 5’pCpA3’

16. 10 塩基で１回転 幅は一定 Watson and Crick’s DNA model 2 nm Purine faces pyrimidine and vice-versa 3.4 nm

17. Mutations • Point Mutations -- DNA複製間違い • 1. transitions 2. transversions 3. frameshift mutations 4.deletion • Structural Mutations -- 染色体の組み換え間違い • 1. Deletions 2. Inversions • 3.Translocations 4. Duplications • Chromosome Mutations -- 細胞分裂間違い • 1. Polyploidy 2. Aneuploidy • transitionとtransversionを総称して • base substitution（塩基置換）という

18. ピリミジン ピリミジン プリン ウラシル(U) アデニン(A) チミン(T) グアニン(G) シトシン(C ) Point Mutations • 1. transitions (change from pupu or pypy) • 2. transversions (pu ⇔ py) • keto-enol tautomerism • thermal depurination (10,000 • adenines per cell per day) • deamination (cytosine), • oxidation (guanine) • replication error • 3. frameshift mutations • replication slippage • 4. Deletion • replication slippage • recombination

19. -GACCC- -CTGGG- 5’-GATCC- 3’-CTAGG- transition Transitionとtransersion -GAGCC- -CTCGG- 5’-GATCC- 3’-CTAGG- transversion Transitionのほうがよく起こる。Transitionやtransversion突然変異生成やそれを抑制する機構に違いがある。 Transition tautomeric shift depurination

20. CH3 CH3 C C H O HO H 5 Tautomeric Shifts C C 4 C C tautomeric shift 6 1 3 N N N N H 2 H H C C O O thymine(通常はケト型)(adenineと対合) thymine(まれにエノール型)(guanineとも対合)

21. アデニン，シトシンのイミノ型へのtautomeric shift 及び グアニン，チミンのエノール型へのtautomeric shiftはおおよそ10-4〜10-5の頻度で起きている。下はグアニンの例。 tautomeric shift OH O 6 6 N N ここが変わる N HN 7 7 5 5 1 1 H H 8 8 2 2 4 4 9 9 3 3 N N NH NH 2 2 N N dR dR ケト型グアニン （正常型） エノール型グアニン tautomeric shiftの結果，dGはdTと結合できるようになる。

22. G T-e normal A T-e チミンtautomerによる変異 G:T-e normal A T tautomeric shift or T-e G A T G C mutant normal 突然変異が生じるためには２回の複製を経る。 G:T-e は，mismatchとして修復の対象となる。

23. Basecommon state pairs withrare statepairs with T keto(=O) A enol (-OH) G G keto C enol T 正常塩基及びtautomerの塩基対合の性質 A imino(-NH) amino(-NH2) C T amino A imino C G All tautomers cause transition mutations

24. Depurination；塩基とdeoxyribose (S)の間に切断が入り，adenine あるいはguanine がDNAから遊離する。 自然塩基損傷，高温などが原因。 P S PurPy S P P S Py Pur S P P S Py Pur S P P S PurPy S P P S Py Pur S P P S PurPy S P P S PurPy S P P S Py Pur S P P S PurPy S P Depurination: 高頻度に生じる自然損傷 Pur depurination P S Py Pur S P P S Py Pur S P P S PurPy S P P S PurPy S P P S PurPy S P P S PurPy S P P S Py Pur S P P S Py Pur S P P S Py S P

25. frameshift mutations • 3. frameshift mutations • main causes • missense repair, • alkylating agents, • oxidative damage • intercalating substances (ethidium bromide, flavones) • replication slippage

26. Frameshift (Replication Slippage) 読みとり枠(reading frame)が変化するような変異のことをframeshift mutationと言う。基本的には複製エラーで生じる。

27. 1) Huntington disease 第4染色体にある。常染色体優性変異第4染色体上のhuntingtin遺伝子が作るタンパク質3145 アミノ酸のHuntingtinの中のグルタミン酸(CAG)繰り返しが、増えて、異常タンパク質が出来、それが脳に蓄積する。 CTGCCGTGCCGGGCGGGAGACCGCCATGGCGACCCTGGAAAAGCTGATGAAGGCCTTCGA METAla Thr Leu Glu Lys Leu MET Lys Ala Phe Glu GTCCCTCAAGTCCTTCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA Ser Leu Lys Ser Phe Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln GCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCCGCCACCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCTCCTCA Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln GCTTCCTCAGCCGCCGCCGCAGGCACAGCCGCTGCTGCCTCAGCCGCAGCCGCCCCCGCC Leu Pro Gln Pro Pro Pro Gln Ala Gln Pro Leu Leu Pro Gln Pro Gln Frameshift mutation and diseases-1 Gln -- CAA CAG Pro -- CCG CCU CCC CCA

28. 2) Fragile X syndrome (FRAX) 脆弱X症候群 x-染色体上のFragile X Mental Retardation 1 (FMR1)遺伝子のCGG繰り返し配列の伸長（200個以上）の結果，遺伝子発現不全となり，「精神障害」などの症状に陥る。 ACGGCGAGCGCGGGCGGCGGCGGTGACGGAGGCGCCGCTGCCAGGGGGCGTGCGGCAGCGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCTGGGCCTCGAGCGCCCGCAGCCCACCTCTCGGGGGCGGGCTCCCGGCGCTAGCAGGGCTGAAGAGAAGATGGAGGAGCTGGTGGTGGAAGTGCGGGGCT 3) Poly-CAG repeat によるHuntington以外の神経系の遺伝病。dentatorubral-pallidoluysian atrophy (DRPLA), spinobulbar muscular atrophy (SBMA) and spinocerebellar ataxia (SCA) types 1—3, 6, 7 and 17 Frameshift mutation and diseases-2 繰り返し（repeated sequence）を複製する際にslipすると，繰り返しの増加や減少(frameshift）が生じる。

29. ATGCCAATCCG ATGCCGATCCG ATGCCGAATCCG ATGCCGATCCG ATGCCG ATCCG Mutation = Damage - Repair substitution A G transitions insertion deletion transversions C deletion T insertion NNNN---N Substitution mutations from one pyrimidine to another or one purine to another (horizontals in diagram) are called transitions. Mutations from a pyrimidine to a purine, or the reverse (verticals and diagonals in diagram), are called transversions. Transitions are more frequent than transversions When ancestry is uncertain, mutations are designated as mutations relative to an arbitrarily chosen "wild type" genome. They are classified as substitution, insertion or deletion mutations. Insertions or deletions can be small (one or a few nucleotides) or large (more than a few dozen nucleotides).

30. Structural Mutations 1. deletions = loss of sequence 2. inversions = reversal of orientation 3. translocations = displacement 4. duplications = multiplication 主な原因: 放射線，紫外線，複製エラー，組み換えエラー,

31. 染色体レベルの突然変異 polyploidy = multiple sets of chromosomes aneuploidy = absence or multiple chromosomes 原因；減数分裂時の染色体不分離，チューブリンの機能不全。がんの発生に強く関わる

32. ゲノム；ある生物がもつ遺伝情報の全体。ゲノムのなかで生命活動を維持するための機能的な部品を規定しているところを遺伝子。遺伝情報の全体は染色体に保持されている。ゲノム；ある生物がもつ遺伝情報の全体。ゲノムのなかで生命活動を維持するための機能的な部品を規定しているところを遺伝子。遺伝情報の全体は染色体に保持されている。 染色体；DNAと核タンパク質の集合体。全遺伝情報がある。多細胞生物は，父親からのと母親からの染色体をそれぞれ持つ（１対）。ヒトは23対持つ。 ゲノム（ゲノム研究） 動原体 テロメア セントロメア 分裂中期の写真なので，染色体が4本ある。

33. 異数体 （aneuploidy） 4倍体 （倍数体） 中心体複製チェックポイントの間違い 紡錘体チェックポイントの間違い Ploidyの変化 チェックポイントの間違いが，染色体の突然変異（数の変化など）を導く 2倍体（diploid） DNA損傷チェックポイントの間違 転座　　　　　　　欠失 遺伝子あるいは染色体の増幅

34. polyploidyの例

35. The consequences of mutation on the phenotype loss of function = hypomorph (“null”) 多くの突然変異 gain of function = hypermorph proto-oncogene→oncogene haploinsufficiency (+/-)の場合，酵素量が半分になり，機能が半分になる。 dominance and recessiveness ヒトなどのように染色体が2nで，遺伝子の片一方が変異で，片一方が正常の時に，正常形質が現れると劣性変異（recessive），変異形質が現れると優性（dominant）という。

36. The consequences of mutation on the phenotype somatic mutations = cell death and cancer germ-line mutations = heritable diseases it is assumed that every person has between 1-2 lethal alleles (heterozygosity protects from deleterious effects of mutations)

37. +/+ -/+ Point mutation etc. heterozygosity 変異細胞 -/- 変異形質が現れる -- その変異はdominant 変異形質が現れない--その変異はrecessive Haploinsufficiencyと劣性との区別が時に必要 Haploinsufficiencyとdominant negativeとの区別が時に必要

38. Glycosylase Endonuclease Glycosylase Endonuclease mismatch mismatch Exo/Hel Exo/Hel UV、活性酸素等 DNA polymeraseが関わる突然変異 YファミリーDNAポリメレース (dinB, umuCD, RAD30, XPV等) Glycosylase, Endonuclease, Exonucease, Helicase (polA, recJ, recQ, hns, topB, RAD27, FEN1等)

39. 組み換えが関わる突然変異；gross rearrangement damage apoptosis p53 cell cycle arrest HR NHEJ LOH GCR

40. 突然変異の生成 • DNA 複製に依存して生成するもの • 1) Point Mutations • 1. transitions 2. transversions 3. frameshift mutations • 2) Structural Mutations（小さいサイズ変化） • 1. deletions 4. duplications • 染色体(DNA) 組み換えに依存して生成するもの • Structural Mutations(LOH，GCR) • 1. deletions 2. inversions3.translocations • 4. Duplications • 細胞分裂に依存して生成するもの • 1. Polyploidy 2. Aneuploidy

41. 紫外線 Ultraviolet Light UV-A--360 nm以上、UV-B--280 or 290-360 nm、UV-C--280 nm 以下

42. 紫外線（UV）によるDNA損傷 thymine thymine cyclobutane thymine dimer 6-4 photoproduct

43. 1 10-1 10-2 10-3 10-4 wild-type 組み換え修復の欠損した大腸菌(recA)及び除去修復欠損大腸菌(uvrA)は，紫外線に感受性で，両方欠損した二重欠損株(uvrA recA)はきわめて感受性となる。二重変異株の場合，約1個のDNA損傷で，大腸菌は死ぬ。 紫外線感受性大腸菌 recA 生存率 uvrA、uvrB、uvrC uvrA recA 0.5 1 0 10 20 30 40 50 紫外線線量(J/m2)

44. 除去修復モデル UvrAタンパク質は UvrBタンパク質を呼び 込みUvrBを傷に結合さ せる。 Molecular Match Maker UvrBとUvrCが切れ目を 入れる

45. 色素性乾皮症（Xeroderma Pigmentosum; XP）

46. XP Patient 色素性乾皮症(XP)は，光線過敏症の常染色体劣性遺伝性皮膚疾患である。 　この疾患の病因は，紫外線によるＤＮＡ損傷の修復機能の障害によるものである。又，XPは8群（Ａ〜G群とバリアント群）に分類され，日本人に多いＡ群は，皮膚疾患に加え，進行性の中枢神経障害や末梢神経障害が出現する。

47. 皮膚細胞を用いてXP患者がなぜ紫外線に感受性なのかを実験することができる。皮膚がん発症の仕組みを実験することが出来る。皮膚細胞を用いてXP患者がなぜ紫外線に感受性なのかを実験することができる。皮膚がん発症の仕組みを実験することが出来る。 正常人の皮膚 色素性乾皮症（XP）患者の皮膚細胞は紫外線に弱い 色素性乾皮症の皮膚 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Kazuo Yamamoto 紫外線 (J/m2)

48. XPと発がん

49. 高等生物の除去修復

50. RNA ポリメラーゼII XPE (UV DDB) 高等生物の除去修復 損傷の認識 XPC-HHR23B CSA，CSB XPG 傷の認識 Transcription coupled repair (TCR) Global genomic repair (GGR) TFIIH (XPB， XPD) 損傷周囲の二本鎖DNAの巻き戻し XPA ERCC1-XPF XPG 損傷両端での一本鎖DNA切断 RPA 傷のあるoligonucleotideの切り出し PCNA RFC DNAポリメラーゼdまたはe 修復合成 DNAリガーゼ DNA鎖再結合