Analytické metody

1. Analytické metody Vladimíra Kvasnicová

2. SPEKTROFOTOMETRIE • CHROMATOGRAFIE • POTENCIOMETRIE • VOLUMETRIE

3. Spektrofotometrie spektrofotometr

4. Materiál používaný pro analýzu: ROZTOK

5. PRINCIP • interakce mezi stanovovaným analytem a monochromatickým zářením • část záření je absorbovánastanovovanou látkou, zbývajícízáření je detekováno detektorem • množství absorbovaného záření je přímoúměrné množství analyzované látky

6. Spektrofotometrie je kvantitativní metoda:stanovujemeKONCENTRACI  koncentrace  tmavší roztok  absorpce

7. Důležité termíny vzorek = analyzovaný roztok neznámý vzorek = vzorek o neznámé koncentraci standard = vzorek o známé koncentraci blank = roztok neobsahující analyzovanou látku chromofor = část struktury chemické látky, která je schopna absorbovat záření určité vlnové délky

8. fialová 380 – 450 nm modrá 450 – 495 nm zelená 495 – 570 nm žlutá 570 – 590 nm oranžová 590 – 620 nm červená 620 – 750 nm viz. http://en.wikipedia.org/wiki/Electromagnetic_spectrum

9. Obrázek převzat z http://en.wikipedia.org/wiki/Electromagnetic_spectrum (2006)

10. Používané elektromagnetické záření • barevné vzorky: viditelné (VIS) • bezbarvé vzorky: UV záření

11. A /  „absorpční spektrum“

12. Komplementární barvy

13. SCHÉMA spektrofotometru

14. Které veličiny jsou měřeny? TRANSMITANCE = poměr intenzity záření vystupujícího z kyvety (I) k intenzitě záření do kyvety vstupující (Io) (tj. záření dopadající na detektor / původní záření) T = I / Io T = 0 – 1 nebo v procentech % (0 – 100 %)

15. Jak se vyjadřuje množství pohlceného záření? veličina odvozená od transmitance: ABSORBANCE A = - log10 T = - log10 (I/I0) = log10 (I0/I) = log10 (1/T) A = 0 – 1.0 (1.5 nebo více) horní limit závisí na citlivosti detektoru

17.  citlivosti detektoru

18. Zjištění koncentrace: • Lambert-Beerův zákon • Kalibrační křivka • Výpočet pomocí hodnot (A, c) standardních vzorků

19. Zjištění koncentrace: Lambert-Beerův zákon A =  x l x c nebo T = 10- ( x l x c) A = absorbance (A = -log T) T = transmitance (T = 10-A)  = molární absorpční („extinkční“) koeficient l = tloušťka kyvety (v cm), c = molární koncentrace

20. Kalibrační křivka 3 a více standardů zpracovaných stejnou metodou lineární kalibrační křivka A =  x lxc y = kx + q

21. Výpočet pomocí standardů Ast = cstx l xAvz = cvzx l x  Ast / cst = l xAvz / cvz =l x  l x = l x Ast / cst = Avz / cvz cvz= Avz x(cst /Ast) cvz = Avz x f f = průměr všech (cst /Ast) použitých při experimentu

22. Cvičení 1) Avz = 0,25 Cvz = ? Ast = 0,40 Cst = 4mg / L 2) standard glukózy: Cs = 1000mg/L, T = 0,49. neznámý vzorek: T = 0,55, Cvz = ? (v mg/L i mmol/L) MW = 180g 3) standard proteinů: T = 0,33;vzorek pacienta: T =0,44 Porovnejte koncentraci proteinů ve vzorku pacienta se standardem.

23. Přesnost stanovení absorpce ostatními látkami přítomnýmive vzorku musí být eliminována: BLANK (slepý pokus) → jeho absorbance se odečte od absorbance vzorku  výsledná absorbance odpovídá pouze koncentraci analyzované látky

24. Spektrofotometrie vpraktickém cvičení „Stanovení koncentrace kreatininu v moči“ analyzovaný vzorek: vlastní moč • bezbarvý kreatinin je převeden na barevný produkt chemickou reakcí • koncentrace kreatininu ve vzorku se zjišťuje z naměřené absorbance pomocí kalibrační křivky

25. Chromatografie chromatograf

26. Všechny chromatografické techniky nejsou instrumentální... TLC chromatografie = úkol v praktiku

27. PRINCIP Separace směsi různých látek je založena na rozdílné distribuci látek mezi dvěnemísitelné fáze: • stacionární fáze (pevná nebo kapalná) • mobilní fáze (kapalná nebo plynná) Mobilní fáze unáší jednotlivé vzorky skrz stacionární fázirozdílnou rychlostí v závislosti na jejich afinitě k fázím.

28. pokud je „afinita“ látky k mobilní fázi vysoká, látka putuje systémem rychleji než látka s nižší afinitou • pokud je „afinita“ látky ke stacionární fázi vysoká, látka je ve stacionární fázi déle zadržována a pohybuje se sytémem pomaleji než látka mající nižší afinitu

29. Obrázek převzat z http://www.chemistry.vt.edu/chem-ed/sep/lc/lc.html (listopad 2006)

31. Co je cílem analýzy? • rozdělit (separovat) od sebe jednotlivé látky • identifikovat látky (= kvalitativní analýza) • stanovit koncentraci přítomných látek (= kvantitativní analýza)

32. Klasifikace chromatografických technik • podle mobilní fáze • kapalinová chromatografie (LC) • plynová chromatografie (GC) • podle uspořádání • planární (rovinná) chromatografie • chromatografie v koloně

33. kapalinová v koloně „manuální“ chromatografie

34. kapalinová v koloně „instrumentální“ chromatografie

35. příklad: kapalinová planární chromatografie

36. Plynová chromatografie (GC) Obrázek převzat z http://www.cofc.edu/~kinard/221LCHEM/ (listopad 2006)

37. podle fyzikálně-chemických interakcí • adsorpční chromatografie • rozdělovací chromatografie • gelová permeační chromatografie (GPC) • chromatografie na iontoměničních(IONEX) • afinitní chromatografie

38. Fyzikálně-chemické mechanismy separace sítový efekt – gelová chromatografie adsorpce rozpouštění iontová výměna specifická interakce- afinitní chromatografie Snímek převzat z prezentace analyticke_metody / Petr Tůma

39. Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006)

40. Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006)

41. Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006)

42. Vyhodnocení chromatogramu 1) planární chromatografie (př. TLC) Porovnání skvrn se standardy: Rf = a /b Rf = retardační faktor („rate of flow“) a = vzdálenost start-střed skvrny b = vzdálenost start-čelo mobilní f. „b“ „a“ Obrázek převzat zhttp://sms.kaist.ac.kr/~jhkwak/gc/catofp/chromato/tlc/tlc.htm (listopad 2006)

43. 2) chromatografie v koloně (HPLC, GC) • Porovnání „píků“ se standardy: • tR = retenční čas • identifikace látek h = výška píku  koncentrace látek „píky“

44. Chromatografie v praktickém cvičení „ TLC lipofilních barviv“ = adsorpční planární kapalinová chromatografie • mobilní fáze: toluen (nepolární) • stacionární fáze: destička se silikagelem (polární) • stadardy barviv → porovnání Rf • neznámý vzorek: obsahuje 2 různá barviva

45. „Demonstrace HPLC a GC“ HPLC = High Performance Liquid Chromatography (vysokoúčinná kapalinová chromatografie) • normální nebo reverzní fáze • princip (vysokoúčinná, vysokotlaká chromatogr.) GC = Gas Chromatography(plynová chromatografie)

47. Potenciometrie potenciometr

48. PRINCIP Potenciometrie je elektrochemická metoda založená na měření napětí elektrochemického článku za bezproudého stavu. dvě elektrody: • indikační (měřící) elektroda • referentní (srovnávací) elektroda

49. Schéma:

50. Elektrody indikační elektroda její potenciál závisí na složení roztoku referentní elektroda její potenciál je stabilní (konstantní, známý) Měřit přímo potenciál jako takový nelze  měříme rozdíl potenciálů (=napětí)