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Obtendo as sequências moleculares: Amplificação e sequenciamento. Almir R. Pepato. Reação da Polimerase em cadeia (PCR). Reação da Polimerase em cadeia (PCR). Otimizando as reações de PCR. Extração Polimerase Mg++ Iniciadores (Primers) DNTP Tampão Substâncias facilitadoras.
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Obtendo as sequências moleculares: Amplificação e sequenciamento Almir R. Pepato
Otimizando as reações de PCR Extração Polimerase Mg++ Iniciadores (Primers) DNTP Tampão Substâncias facilitadoras Temperatura e tempo : -Denaturação -Anelamento -Extensão
Extração • Contaminação • Deve- se usar um controle negativo. • Autoclavar ponteiras, frascos etc. • Aliquotar as soluções (isso restringe a contaminação) • Planejar o espaço físico do laboratório. • Degradação e quantidade: • Quantidade: • Ideal: 0.1-1 μg DNA /100 μl de solução para o PCR • Muito DNA: Amplificações espúrias. • O DNA degradado pode ser eventualmente “restaurado”. Substâncias que inibem o PCR: álcool, formol, fenol, detergentes polares, vários metais.
Cloreto de Magnésio (Mg++) e DNTP O Mg++ forma complexos com dNTPs, primers e DNA, mas o efeito do dNTPs é mais pronunciado. Pouco Mg++, pouco produto de PCR/ Muito Mg++, baixa especificidade
Iniciadores (Primers) • O desenho de primers será objeto de aula a parte. Alguns elementos: • Devem ter de 0-24 nucleotídeos de comprimento • O conteúdo de GC deve estar em 40%-60% • Não deve ser auto-complementar nem parear com o seu reverso • O par de primers não devem ter Tm’s (veja abaixo) diferindo em mais de 5°C • É uma boa idéia ter uma timina na extremidade 3’ para primers universais e GC para primers específicos 0,4 mM 0,2 mM
Substâncias facilitadoras Substâncias como DMSO (2%-5%), glicerol (500-20%), detergentes apolares, formamida (5%) e BSA podem aumentar o produto das reações ou melhorar a especificidade . Algumas reações só funcionam com eles!
Ciclo de temperaturas O número de ciclos, temperaturas e tempo de duração de cada etapa do ciclo também é objeto de otimização! Os principais parâmetros são a temperatura de anelameto, o número de ciclos e a duração do tempo de extensão. Para oligos com < 25nts, Tm ± 4 (G + C) + 2 (A + T). A diferença entre as temperaturas dos primers não deve ser maior que uns 5°C. A temperatura ideal de anelamento deve ser uns 5°C menor que Tm. Temperatura ótima esperada: 56,5°C. Inferida pelo gradiente: 63°C
E quando mais nada funciona? Santa Rita de Cássia, santa das causas impossíveis.
PCR Aninhados Consiste em amplificar um fragmento menor a partir de um produto inespecífico ou escasso de outro PCR.
“Touchdown” e “Hot start” Touchdown: A cada ciclo a temperatura é reduzida, tornando o anelamento cada vez menos específico, mas mais eficiente Hotstart: A Taq polimerase só é adicionada quando a temperatura atingiu um valor mínimo.
Sequenciamento: Método de Sanger Originalmente: Quatro reações diferentes com cada uma das quatro bases modificadas por vez (mais as versões normais de todas)
