Rôle des isoformes de laminine dans la différenciation des cellules epithéliales intestinales

1. Frédéric André, mai 2005 frederic.andre@pharmacie.univ-mrs.fr Rôle des isoformes de laminine dans la différenciation des cellules epithéliales intestinales

2. -Tissu formé d'une ou de plusieurs couches de cellules qui recouvre le corps, les cavités internes ou qui constitue les glandes. -Les épithélium se caractérisent par: des mécanismes d'adhésion leur différenciation qui leur permet de remplir un rôle spécifique (absorption, secretion ou de barrière) Épithelium

3. On appelle differenciation cellulaire des modifications qualitatives du phénotype qui résultent de la synthèse d'un nouveau produit codé par un gène. La différenciation

4. Pourquoi l'intestin pour modele? • Différenciation au cours de l'organogénèse • Differenciation chez l'adulte le long de l'axe crypte-villosité

5. Organogénèse de l'intestin

6. Intestin adulte • Principal organe d'absorption • Barrière entre milieu extérieur et le milieu intérieur • Possede de nombreuses modifications structurales

7. Structure de l'intestinLes replis transversaux

8. Structure de l'intestin les villosités

9. Structure de l'intestinles microvillosités

11. Les différentes zones villosité col crypte

12. Les quatres principaux types de cellules • Villosité: cellules absorbantes, cellules en gobelet, cellules enteroendocrines • Crypte: cellules en gobelet, cellules enteroendocrines, cellules de Paneth

13. Les entérocytes

14. Devenir d'une cellule souche MORT Différenciation Tris (rester dans les cryptes ou migrer?) Spécification (absorbtion ou secretion?) Prolifération Auto-renouvellement

15. Cellules souchesdivision asymétrique

16. balance prolifération différenciation

17. La matrice extracellulaire D'après de Duve C: une visite guidée de la cellule

18. Une vieille expérience...Matrice extracellulaire et différenciation

19. Cellules de crypte PL ECM Cellules de villosité PL ECM

20. Les isoformes de laminine

21. Les isoformes de lamininedans l'intestin

22. Laminines et organogénèse

23. INSERM, Unit 381, 67200 Strasbourg, France. Laminin isoforms: biological roles and effects on the intracellular distribution of nuclear proteins in intestinal epithelial cells Turck N, Gross I, Gendry P, Stutzmann J, Freund JN, Kedinger M, Simon-Assmann P, Launay JF. Experimental Cell Research 303 (2005) 494-503

24. Cellules CaCo2 Ln-1 Rôle dans: L’adhésion La prolifération La différenciation Ln-2 Ln-5 Ln-10

25. isoformes de laminine et adhésion des cellules intestinales

26. conclusions • Les isoformes de ln ont des effets differents sur l'adhésion et l'étalement des cellules. • La ln -10 est la plus adhésive, suivie de la ln-2 et ln-5 et de la ln-1. • Les isoformes de ln sont donc distincts fonctionnelement.

27. ISOFORMES DE LAMININE ET PROLIFERATION

28. Conclusions • Morphologie des cellules: clones plus petits lorsque les cellules sont déposéee sur ln-1. (cellules plus compactes sur ln-1) • Prolifération: ln-2, ln-5 et ln-10 mais pas la ln-1 augmentent la prolifération des cellules • Ln-2, ln-5 et ln-10 fournissent des stimuli de prolifération.

29. ISOFORMES DE LAMININE ET DIFFERENCIATION

30. conclusion • Seule la ln-1 induit la différentiation des enterocytes • via l'induction du facteur de transcription cdx-2?

31. Cdx-2 et differenciation • Gene homeotique retrouvés dans l’intestin. • Transfection des cellules Caco-2 par: • Cdx-1 sens: surexpression de cdx-1 • Cdx-1 antisens: association avec l'ARNm de cdx-1 endogène; sous expression de cdx-1 • Cdx-2 sens: surexpression de cdx-2

32. Cdx-2 et differenciation Courbe de croissance Proteines ARNm

33. conclusion Cdx-2 induit la différenciation des cellules intestinales

34. Conclusion générale • Les isoformes de ln n'ont pas la même fonctionnalité. • ln-1 induit la différenciation • ln-2, ln-5, ln-10 stimulent l'adhésion et la prolifération Les isoformes de ln participeraient à l'equilibre prolifération/différenciation.

35. La ln-1 induit aussi la différenciation des glandes mammaires... Elle contrôle la transcription des protéines du lait Le mecanisme fait intervenir STAT 5 La ln-1induit aussi la différenciation des glandes thyroïde...via d’autres facteurs de transcription Autres systèmes cellulaires...

36. Etudes in vivo... Intégrines... Autres facteurs de transcription... Pathologies associées à un defaut de laminine... Comment peut on aller plus loin dans l'étude?

37. TD 2

38. Rappel Migration Differenciation

39. balance prolifération différenciation

40. Un cas particulier: la restitution intestinale blessure dédifferenciation migration prolifération différenciation

41. Rôle important de la Matrice extracellulaire dans la différenciation intestinale. • Mais elle n’est certainement pas le seul stimulus de différenciation • Autre hypothèse: le processus est dirigé par une horloge moléculaire intracellulaire.

42. p27(Kip1) is an inducer of intestinal epithelial cell differentiation.Quaroni A, Tian JQ, Seth P, Ap Rhys C. • Section of Physiology, Cornell University, Ithaca, New York 14853, USA • Am J Physiol Cell Physiol. 2000 Oct;279(4):C1045-57.

43. Cyclin-dependent kinase inhibitors (CKI) • Il en existe plusieurs: p27 Kip1 (p27), p21 Cip1/WAF1 (p21), p16… • Correlation entre l’expression de cki et le degré de différenciation. • surexpression de p21 dans les cellules intestinales différenciées • p27 dans les kératynocytes: l’augmentation de l’expression de p27 est concomittant avec la différenciation. Un oligonucléotide antisens de p27 inhibe la differenciation. • Rôle de p27 dans la différenciation des cellules intestinales?

44. Méthode • Utilisation de la lignée HIEC6: cellules issues de cryptes • Surexpression par infection de: • Vecteur seul Adnull • p16 Adp16 • p21 Adp21 • p27 Adp27 Analyse de la prolifération, des différentes phases du cycle cellulaire, de la morphologie des cellules, de l’expression de marqueurs de différenciation

45. Contrôle de l’expression des ckis Les cellules sont infectées à différentes concentrations d’adenovirus. Apres 24 heures analyse des differentes protéines par Western blot

46. Contrôle de l’expression des ckis • Analyse par immunocytochimie de l’expression des cki

47. Conclusions • L’infection des cellules par l’adenovirus + cDNA exogène induit l’expression des ckis • La surexpression de P21 entraine l’expression de P27 (P27 sous le contrôle de p21?)

48. Cki et prolifération A:1 jour après infection B: effet dose de l’adenovirus sur la prolifératiopn C: étude cinétique

49. Brdu (bromodeoxyuridine) Ac X-Brdu Ac X-Ac X-Brdu

50. Cki et prolifération A:1 jour après infection B: effet dose de l’adenovirus sur la prolifératiopn C: étude cinétique