1 / 20

OOCYTY MYSZY STOPNIOWO ROZWIJAJĄ ZDOLNOŚĆ DO AKTYWACJI W CZASIE BLOKU METAFAZY II

OOCYTY MYSZY STOPNIOWO ROZWIJAJĄ ZDOLNOŚĆ DO AKTYWACJI W CZASIE BLOKU METAFAZY II. Jacek Z. Kubiak. Wprowadzenie. W normalnych warunkach dojrzałe oocyty są zapładniane w czasie bloku metafazy II (MII).

armine
Download Presentation

OOCYTY MYSZY STOPNIOWO ROZWIJAJĄ ZDOLNOŚĆ DO AKTYWACJI W CZASIE BLOKU METAFAZY II

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. OOCYTY MYSZY STOPNIOWO ROZWIJAJĄ ZDOLNOŚĆ DO AKTYWACJI W CZASIE BLOKU METAFAZY II Jacek Z. Kubiak

  2. Wprowadzenie • W normalnych warunkach dojrzałe oocyty są zapładniane w czasie bloku metafazy II (MII). • Wniknięcie plemnika powoduje ukończenie II podziału mejotycznego, wyrzucenie II c.k. i przejście do interfazy. • Niedojrzałe oocyty nie są zdolne do aktywacji przez wniknięcie plemnika. Jądro plemnika nie tworzy wtedy przedjądrza, jego DNA tworzy grupki silnie skondensowanej chromatyny. • Wniknięcie plemnika w czasie prometafazy lub metafazy I prowadzi do powstania skondensowanych chromosomów z jądra plemnika

  3. Wprowadzenie c.d. • Zachowanie chromatyny oocytu i plemnika po wniknięciu w M I zależy od liczby plemników: • Monospermia lub oligospermia może opóźnić dojrzewanie, ale prawie nie wpływa efekt końcowy: silnie skondensowane chromosomy oocytu i plemnika • Wysoka polispermia powoduje najczęściej przejście do iterfazy • 4-6 plemników daje efekt pośredni (zwykle blokada w MI, chromosomy oocytu skondensowane, jądro plemnika nie tworzy chromosomów) • Oocyty w Metafazie I mogą być zatrzymane w interfazie przez puromycynę lub cykloheximid (inhibitory syntezy białek) • Inhibicja syntezy białek w M II prowadzi do aktywacji partenogenetycznej

  4. Cel doświadczeń Pokazanie, że: • oocyty stopniowo osiągają zdolność do aktywacji w czasie bloku M II • dojrzewanie jądra i cytoplazmy to 2 osobne procesy • czas nabycia zdolności do aktywacji zależy od czynnika pobudzającego oocyt

  5. Zastrzyk z PMSG 48-52 godz. Zastrzyk z HCG 10-10,5 godz. Wykłuwanie oocytów z jajników Wydobycie oocytów z jajowodów powyżej 11 godz. Pożywka M2+BSA Materiały i metody Otrzymanie oocytów zatrzymanych w MII:

  6. Usunięcie osłonki przejrzystej (kwaśny roztwór Tyrode’a, -chymotrypsyna lub 0,5% pronaza) Usunięcie I c.k. (delikatne pipetowanie) Wykłucie oocytów z pęcherzyków jajnikowych 4-tygodniowych myszy z F1 Działanie roztworem 8% etanolu (6,5 min) Płukanie w pożywce M2 Hodowla w pożywce M2 pod płynną parafiną (37ºC, 5%CO2) Hialuronidaza (usunięcie komórek pęcherzykowych) Hodowla w pożywce Witttena pod płynną parafiną (37ºC, 5%CO2) Aktywacja partenogenetyczna: Dojrzewanie in vitro:

  7. Kapacytacja (1 godz. W pożywce Whittinghama, pod płynną parafiną; 37ºC, 5%CO2) Rozcieńczenie zawiesiny plemników (106 plemników/ml) Wymieszanie z oocytami pozbawionymi osłonki przejrzystej (10 min.; dla polispermii zwiększenie koncentracji plemników lub dłuższy czas inkubacji) Hodowla w pożywce M2 pod płynną parafiną (37ºC, 5%CO2) Zapłodnienie in vitro: • Z oocytów wykonywano białkowe preparaty totalne barwione hematoksyliną i suszone preparaty barwione barwnikiem Giemzy

  8. Wyniki • Oocyty używane w doświadczeniach były poddawane aktywacji w czasie od 11 do 21,5 godzin po wstrzyknięciu HCG • In vivo oocyty są zapładniane między 13 a 18 godziną •  Czas aktywacji w przeprowadzonych doświadczeniach zawiera cały naturalny okres zapłodnienia

  9. Rys. 1 (lewa strona) Typy reakcji oocytów na aktywację partenogene-tyczną: pozostanie w MII; stadium „MIII” – płytka metafazalna utworzona przez pojedyncze chromatydy (kilka płytek zawierało nieprawidłową liczbę chromatyd – hipohaploidalne lub hiperhaploidalne); niektóre oocyty wciągnęły IIc.k. 2-3 godz. po wyrzuceniu („stadium 40 chromatyd); stadium jąder telofazowych (gęste skupienia chromatyny w oocycie i II c.k.); stadium jądra retikularnego; stadium przedjądrza (prawidłowe przejście do interfazy) Aktywacja partenogenetyczna • Preparaty z oocytów wykonywano 5-7 godzin po aktywacji etanolem (czas wystarczający, aby oocyty utworzyły przedjądrza)

  10. Rys. 2 Nieprawidłowe reakcje oocytów na bodziec partenoge-netyczny: A) Oocyt w stadium M III (preparat totalny); B) Oocyt MIII: 20 pojedynczych chromatyd (preparat suszony); C)stadium 40 chromatyd (preparat suszony); D)Stadium jądra telofazowego: wyraźnie wybarwione grupy chromatyny w oocycie i II c.k. (preparat totalny); E) Oocyt MII: każdy chromosom składa się z 2 chromatyd Rys. Stadium przedjądrzy

  11. Wiek oocytów po wstrzyknięciu HCG Typy reakcji (% oocytów)) Całkowita liczba oocytów M II Stadium 40 chroma-tyd M III Jądro telofazowe Jądro retikularne Stadium przedjądrzy 11 57,6 1,7 35,6 1,7 - 3,4 59 13 3,6 1,3 48,2 1,3 - 45,6 224 16 1,9 - 7,6 13,3 7,7 69,5 105 17,5 - 1,8 3,5 5,4 1,8 87,5 56 21,5 - - - - - 100 91 Tab. 1 Typy odpowiedzi oocytów na partenogenetyczną aktywację w zależności od wieku oocytów po wstrzyknięciu HCG • Częstość pojawiania się danej reakcji oocytu zależała od czasu, jaki minął od zastrzyku HCG • Zdolność oocytów do prawidłowej aktywacji partenogenetycznej jest uzyskiwana stopniowo w czasie bloku M II • Po 17,5 godzinach ciągle istotna część oocytów (12,5 %) reaguje nieprawidłowo

  12. Zapłodnienie in vitro • Rys. 1 (prawa strona) Typy reakcji oocytów na pobudzenie przez plemnik: pozostanie w M II (brak reakcji); M III (wyrzucenie II c.k. i zatrzymanie w metafazie); stadium jądra telofazowego; stadium przedjądrzy • Brak stadium 40 chromatyd i stadium jądra retikularnego. • Nieprawidłowa reakcja tylko w przypadku aktywacji po 11 i 12 godzinach; aktywacja od 13 godziny powodowała normalną aktywację oocytu • Oocyty zapładniane in vitro między 13 a 17 godziną tworzą przedjądrza • W doświadczeniu badano zachowanie oocytów zapładnianych między 11 a 13 godziną

  13. Rys 3. (A-C) Chromatyna w oocytach myszy zapłodnionych na początku bloku M II (preparaty suszone); A) Chromosomy plemnika przypominające profazę 6 godzin po zapłodnieniu, w oocycie widać było też chromatydy stadium M III; B) 2 grupy chromosomów 8 godzin po zapłodnieniu (reakcja oocytu: M III); C) Dispermia; reakcja oocytu (8 godz. po zapłodnieniu): widać 3 skupienia chromatyny wewnątrz oocytu.

  14. Tab. 2 Typy reakcji oocytów na zapłodnienie in vitro w różnym czasie po zastrzyku z HCG

  15. Reakcje oocytów na wniknięcie różnej liczby plemników • Monospermia: w przeciwieństwie do aktywacji partenogenetycznej, już w 11 godzinie po wstrzyknięciu HCG większość oocytów zareagowała prawidłowo; po 12 godzinach wzrosła liczba prawidłowo reagujących oocytów • Dispermia: tylko w 11 godzinie pojawiły się nieprawidłowe reakcje • Polispermia: badano tylko reakcje oocytów zapładnianych w 11 godzinie po wstrzyknięciu HCG. Z 57 oocytów tylko 1 nie przeszedł do interfazy (nie utworzył przedjądrzy): trispermia – oocyt zatrzymał się w M III, pozostałe trispermie – powstały przedjądrza. Powyżej 5 plemników:powstawało tylko 1 przedjądrze,pozostałe jądra plemników zablokowane w rozwoju (chromatyna pozostała skupiona) • Oocyty stopniowo uzyskują zdolność do aktywacji • Różne bodźce mają różną siłę: polispermia jest mocniejszym sygnałem niż monospermia, a monospermia niż aktywacja alkoholowa

  16. Stadium M III • Stadium to jest osiągane, kiedy oocyt jest w stanie wyjść z bloku M II i ukończyć podział, ale nie jest w stanie przejść do interfazy • Po 2-3 godzinach od wyrzucenia II c.k., odpada ono bardzo łatwo od oocytu • Czy blok M III jest podobny do M II? Doświadczenia: • 43 oocyty oocyty zatrzymane w M III poddano ponownemu działaniu etanolu 8% 2,5-4 godz. po pierwszej aktywacji. Większość (40 oocytów nie zareagowała: pozostała w M III), 2 utworzyły przedjądrza, a 1 zatrzymał się w M IV. • Oocyty zatrzymane w M II (traktowane etanolem 14 godz. po wstrzyknięciu HCG) 5 godzin później ponownie poddano działaniu etanolem. Większość (78%) pozostała w MII, pozostałe przeszły w stadia: MIII, jądro retikularne, jądro telofazowe, przedjądrza. W kontroli (oocyty 19 godz. po zastrzyku z HCG, bez wcześniejszego traktowania etanolem) większość (88,4%) utworzyła przedjądrza. •  Ponowne działanie etanolem jest mało wydajne: zarówno oocyty zatrzymane w M II jak i w M III w większości przypadków pozostają zablokowane.

  17. Rys 3. (D,E) Wniknięcie plemnika spowodowało wyrzucenie II c.k.Oocyty były hodowane przez noc w obecności kolcemidu (preparaty suszone) D) Po lewej: 9 chromosomów pochodzących z aneuploidalnego przedjądrza żeńskiego (wywodzącego się z M III); po prawej: grupa chromosomów profazowych przedjądrza męskiego; E) po lewej:8 chromosomów aneuploidalnego przedjądrza żeńskiego; po prawej: chromosomy przedjądrza męskiego Doświadczenia: 3. Oocyty w M III poddano działaniu innego czynnika partenogenetycznego: puromycyny. Z 10 oocytów, 9 przeszło do interfazy. 4. Oocyty w M III poddano zapłodnieniu in vitro. Wszystkie oocyty, do których wniknął plemnik wyrzuciły III c.k.; jądra plemników uległy dekondensacji. 4 oocyty poddano działaniu kolcemidu przez noc: w 3 przedjądrza uległy rozpadowi.  Blok M III jest podobny do bloku M II i może być zwolniony po wniknięciu plemnika. Aktywacja oocytów M III powoduje rozpoczęcie ruchów anafazowych i wyrzucenie III c.k.

  18. Rys.  Rola IP3 w uwolnieniu jonów Ca2+; Regulacja cyklu komórkowego w czasie mejozy Podsumowanie Oocyty myszy stopniowo uzyskują zdolność do aktywacji w trakcie bloku M II. • Doświadczenia pokazują, że ruchy anafazowe i dekondensacja chromosomów to dwa niezależne procesy: w obecności kolcemidu (brak wrzeciona podziałowego) oocyty są w stanie przejść do interfazy; w oocytach zatrzymanych w M III zaszły ruchy anafazowe, ale chromatyna nie przeszła do stadium interfazy • Autor zastanawia się nad rolą oscylacji stężenia jonów Ca2+ w dojrzewaniu oocytów (wyjściu z bloku M II). Obecnie znany jest szlak przekaźnictwa prowadzący do wzrostu stężenia jonów Ca2+, jony te przyczyniają się do rozpadu MPF.

  19. Mechanizm ruchu chromosomów w czasie wyjścia z M III jest nietypowy: pojedyncze chromatydy nie mogą już być rozdzielone tak jak normalne chromosomy. • Nietypowe jest łatwe odpadanie II c.k. w M III. Zwykle II c.k. pozostaje silnie związane z oocytem (rola midbody). Tutaj II c.k. zachowuje się jak I c.k. w normalnej mejozie. • Oocyty w 13 godzinie są w pełni zdolne do aktywacji przez plemnik, w przeciwieństwie do działania 8% etanolem. Zdolność oocytu do reakcji zależy od rodzaju bodźca aktywującego. • U myszy w oocytach pozostających w M II lub M III chromatyna tylko 1 plemnika tworzy chromosomy. • Dojrzewanie cytoplazmatyczne i jądrowe to 2 różne procesy. • Oocyty w M I mogą być aktywowane partenogenetycznie: traktowane najpierw puromycyną, potem dbcAMP

  20. KONIEC

More Related