TIPOS DE MÉTODOS RÁPIDOS

1. TIPOS DE MÉTODOS RÁPIDOS

2. MÉTODOS RÁPIDOS • Os métodos rápidos tomaram impulso na década de 90 com o impacto dos custos crescentes com lead time para a liberação dos produtos para o mercado consumidor. • Podemos dizer hoje que os métodos rápidos e a automação fazem parte de uma área dinâmica da microbiologia aplicada que tem como áreas principais:

3. MÉTODOS RÁPIDOS • O isolamento dos microrganismos. • A detecção precoce. • A identificação dos microrganismos. • A quantificação dos microrganismos.

4. Métodos rápidosidentificação

5. MÉTODOS RÁPIDOS • Métodos rápidos para identificação microbiana • Vitek –depende do crescimento bacteriano, utilização de carbohidratos e substratos bioquímicos. • Tempo de incubação 2 a 24 horas • Capacidade de 30 a 60 amostras por dia • Biblioteca > 350 especies bacterianas e leveduras

6. Métodos rápidos • Métodos rápidos para identificação microbiana • Biolog – depende do crescimento microbiano e baseia-se na utilização de carbohidratos • Tempo de incubação – 2 a 72 horas • Capacidade de 100 amostras por dia • Biblioteca > 2000 espécies bacterianas e olores e leveduras

7. Métodos rápidos • Métodos rápidos para identificação microbiana • Phoenix – depende do crescimento microbiano , baseia-se na utilização de substratos bioquímicos e sensibilidade aos antibióticos • Tempo de incubação - 3 horas • Capacidade de 100 amostras por dia • Biblioteca > 230 espécies bacterianas

8. Métodos rápidos • Métodos rápidos para identificação microbiana • MIDI – SHERLOCK MIS - baseia-se na identificação dos ácidos graxos extraídos de colônias isoladas . • Tempo de análise de +/- 2 horas • Capacidade de 100 amostras por dia • Biblioteca de >1500 espécies bacterias e fungos e bolores.

9. Métodos rápidos • Dupont Qualicon + Riboprinter – ribotipagem de fragmentos de DNA • Pathogenetix- marcação fluorescente do DNA • Capacidade de identificar culturas mistas • Bilbioteca extensa > 1000 microrganismos • Outras técnicas – Espectroscopia Raman • FT-IR

10. Métodos rápidos • MALDI-TOF ( MATRIX-ASSISTED LASER DESORPTION IONIZATION – TIME OF FLIGHT) • Baseia-se na análise e detecção de um grande espectro de proteínas, capaz de discriminar espécies estreitamente relacionadas. A matriz utilizar as proteínas foi mudada para que possibilitasse as proteínas ribossomicas , • Neste sistema os microrganismos são colocados em uma placa que contem uma matriz polimérica

11. Métodos rápidos • A placa é irradiada com um laser que vaporiza a amostra ionizando as moléculas que são aspiradas e elevadas a um detetor. • Dependendo da molécula o tempo de chegada será diferente (time offlight), os dados obtidos através destas leituras são comparados a uma base algorítimica que contém uma biblioteca possibilitando a identificação de bactérias, leveduras e fungos.

12. Métodos rápidos para detecção e contagem de microrganismos • Bioluminescência – técnica baseada no princípio da medição da quantidade de Adenosina trifosfato (ATP). • E + LH2 +ATP → E-L2-AMP+ PP • E-LH2-AMP + O2 → oxiluciferina + CO2 +AMP +LUZ • E= Enzima luciferase, lh2 = luciferina , E-LH2-AMP = COMPLEXO LUCIFERASE-LUCIFERINA -AMP

13. Métodos rápidos para detecção e contagem de microrganismos • Equipamentos que utilizam a técnica do ATP -CELSIS,HITACHI,LONZA

14. Métodos rápidos para detecção e contagem de microrganismos • GeneDisc –PallCorp. –princípio – amostras são filtradas em membrana e lisadas através de reagentes específicos –adiciona-se polimerase e desoxinucleotídeos em uma placa própria que contém os primers e os probes . • Quando o DNA de interesse é amplificado ,um sinal fluorescente do probe é detectado e medido . O equipamento vem com 6 probes que permite a realização do teste limite USP em até 1 hora.

15. Métodos rápidos para detecção e contagem de microrganismos • IMPEDÂNCIA-CONDUTÂNCIA – baseia-se na propriedades que os microrganismos têm de alterar a transmissão da corrente elétrica através de um meio de cultura. • Exemplos Rabit, Malthus ,Bactometer

16. Métodos rápidos para detecção e contagem de microrganismos • Outras técnicas disponíveis ´- light scattering, PCR. • Testes de esterilidade – inoculação direta em meio de cultura , medição de CO2 • BACTEC, BACT/ALERT

17. Métodos rápidos de alta sensibilidade • Capacidade de detectar 1 célula – bactérias, leveduras, fungos e esporos. • Carga microbiana de matérias primas , controle em processo, produtos acabados , água e testes de esterilidade. • Vantagens sobre o teste tradicional 14 dias vs 1 a 3 horas • Para amostras filtráveis.

18. Métodos rápidos de alta sensibilidade • Millipore –MilliflexRapid e Quantum • Sensibilidade -1UFC após o crescimento • Rapid –ATP • Sensibilidade 1 UFC • Tempo de incubação -24 horas • Carga microbiana, matérias primas , produtos acabados, água e testes de esterilidade.

19. Métodos rápidos de alta sensibilidade • Milliflex Quantum • Sensibilidade 1 UFC • Quantum –coloração vital , amostra é filtrada e a membrana é inoculada em meio contendo substrato fluorescente , que libera o fluorocromo no citoplasma celular. • Um leitor permite a quantificação das colonias e mesmo a identificação dos microrganismos.

20. Métodos rápidos de alta sensibilidadee • AES ChemunexD-Count e BactiFlow • Sensibilidade 10 a 50 UFC • Carga microbiana de matérias primas, controle em processo, produtos acabados e água. • Coloração vital e citometria de fluxo

21. Métodos rápidos de alta sensibilidade • Citometria de fluxo – o sistema marca o ácido nucléico com um corante fluorescente , sendo que a amostra é lida em um citometro de fluxo . • Amostra filtrada em um filtro membrana ,sendo que o microrganismo retido no filtro é marcado com um substrato não fluorescente • O metabolismo microbiano atua enzimaticamente liberando o fluorocromo, possibilitando a detecção pelo laser.

22. Métodos rápidos de alta sensibilidade • AES Chemunex –ScanRDI • Sensibilidade 1 UFC • Carga microbiana de matérias primas, controle em processo, produtos acabados, água e testes de esterilidade. • Tempo 1,5 horas . • Princípio – coloração vital e citometria de fase sólida.