Přínos imunofenotypizace k diferenciální diagnostice hematoonkologických onemocnění

1. Přínos imunofenotypizace k diferenciální diagnostice hematoonkologických onemocnění M.Bílý, K. Klaricová, L.Novosadová, D. Starostka, M. Wróbel Oddělení klinické hematologie NsP Havířov Prim. MUDr. L. Novosadová

2. Y Y mab2PE mab1 FITC Imunofenotypizace Typizace jednotlivých buněčných populací za využití reakce antigen – protilátka. Reakce je vizualizována označením protilátky fluorochromem (FITC, PE, PC5, aj.). Zjištění imunofenotypu dané populace. Buněčná lokalizace antigenů (markerů, znaků): • Povrchová (membránová). • Intracytoplazmatická. • Nukleární (jaderná). Zdroje vyšetřovaného materiálu v hematologii: • periferní krev • kostní dřeň • tělesné tekutiny (punktáty, likvor, aj.) • suspenze buněk ze solidních tkání po dezintegraci Praktické provedení imunofenotypizace: • Průtoková cytometrie. • Fluorescenční mikroskopie.

3. Možnosti vícebarevného značení (multiparametrová analýza) • V jedinézkumavce vyšetřované buňky + 2 či více protilátek proti různým znakům, každá protilátka označena jiným flurochromem. • Současná analýza exprese několika znaků na jedné buňce. Význam: Získání upřesňujících informací o charakteru vyšetřované populace, konfirmace diagnózy. Příklad: Znaky CD19 (B-lymfocyty) a CD5 (fyziologicky T-lymfocyty) u B-CLL : patologická subpopulace CD19+CD5+ .

4. Přehled CD znaků (CD = Cluster of Differentiation) • T – lymfocyty : CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD2, CD1 , TCR • B – lymfocyty : CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD38, CD11c, CD79b, FMC7, CD40, CD28, CD103, CD138 • NK – buňky: CD16, CD56 • Granulocyty a monocyty: CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD33 • Progenitorové buňky: CD34, CD38, CD117 • Povrchové, event.intracytoplazmatické imunoglobuliny : těžké řetězce IgG, IgA, IgM, IgD, lehké řetězce κ, λ

5. Průtoková cytometrie (flow cytometry) • Metoda kvantitativní a kvalitativní analýzy buněčných či jiných částic, pohybujících se v proudu tekutiny, která protéká v průtokové komůrce přes laserový paprsek. • Identifikace různých buněčných typů uvnitř smíšené buněčné populace, analýza jednotlivých subpopulací v rámci jedné populace. • Rychlá, přesná a reprodukovatelná metoda, umožňující současné měření několika parametrů až na 104 buněk za 1 sekundu.

6. 675BP FL4 (PC5) 620BP FL3 (ECD) 575BP FL2 (RD1) 525BP FL1 (FITC) Laser (Air-cooled Argon Ion Laser) Detektor pro „Side Scatter“ 645DL 600DL 550DL 488BK Čočky upravující tvar paprsku „Beam Shaping Lenses“ 488DL Detektor pro „Forward Scatter“ Průtoková kyveta „High Sensitivity Quartz Flow Cell“ Schéma průtokového cytometru

8. Klinická aplikace imunofenotypizace v hematologii a hematoonkologii • Analýza erytrocytů • Analýza trombocytů • Stanovení retikulocytů • Funkční vyšetření granulocytů • Vyšetření diferenciálního rozpočtu leukocytů • Typizace leukémií: AL – AML, ALL chronické leukémie (např. CLL) • Typizace lymfomů - v leukemické fázi - vyšetření lymfatických uzlin, sleziny • Imunofenotypizace dalších jednotek: myelom, MDS, PNH • Analýza onkoproteinů • Sortování (třídění) buněk dle antigenní výbavy (progenitorové buňky CD34) • Cytometrická DNA analýza (ploidie, obsah DNA, RNA)

9. Přehled hematoonkologických diagnóz 1/1995 – 2/2002 Celkem vyšetřeno 4350 jednotlivých vzorků, tj. 49 870 znaků.

10. Definice lymfocytózy: Zvýšení počtu lymfocytů v periferní krvi • absolutní > 4.0 x 109 / l u dospělých • relativní Diferenciální diagnostika pomocí membránových znaků: • monoklonální ( primární, leukemická) lymfocytóza • polyklonální ( sekundární, reaktivní ) lymfocytóza Důležitost rozlišení patologické lymfocytózy od reaktivní.

11. Monoklonalita v lymfoidních řadách(z pohledu imunofenotypu) B-linie 1. Lehké řetězce imunoglobulinůkappa, lambda. Průměrný poměr 1.5 : 1 . Normální rozsah 0.7-2.5 . Monoklonalita κ:λ , λ:κ> 3:1 . 2. Těžké řetězce imunoglobulinů ( molekuly Ig). Monoklonalita: 1 Ig třída k součtu ostatních >3:1 . 3. Charakteristický imunofenotyp

12. Monoklonalita v lymfoidních řadách (z pohledu imunofenotypu) T linie: 1. Zvýšená exprese pan-T antigenů. 2. Exprese aberantních fenotypů, uniformní imunofenotyp. 3. Porušený poměr CD4/CD8. 4. Typ TCR. 5. Délka trvání T- lymfocytózy ( absolutní počet >4.0 x 109/l po dobu minim. 3 - 6 měsíců ).

13. Imunofenotyp u chronických B - lymfoproliferací Legenda: B – CLL : B – chron. lymf. leukémie MCL : mantle – cell lymfom B – PLL : B – prolymfocyt. leukémie FL : folikulární lymfom HCL : hairy – cell leukémie MZL : lymfom z marginální zóny HCL – V : HCL – variant LPL : lymfoplazmocytoid. lymfom (imunocytom) PCL : plazmocelulární leukémie SLVL : splenický lymfom s vilóz. lymfocyty WM : Waldenström. makroglobulinémie ND : neudáno

14. Skórovacísystém pro B – CLL(podle Matutes a spol.) Rozmezí skóre od 5 (typická B - CLL) do 0 (atypická B - CLL).

15. Přehled stavů diagnostikovaných na OKH NsP Havířov od 6/1997 do 2/2002 Vyšetřeno 249 pacientů s nově zjištěnou absolutní lymfocytózou ( > 4.0 x 109 / l lymfocytů v perif. krvi ). Soubor pacientů: • 249 dospělých pacientů ve věku od 19 do 98 let ( průměrný věk 64.9 let ) • Poměr muži : ženy 145 : 104 ( 1.39 : 1 ) • Počet leukocytů v KO: 5.4 – 536.0 x 109 / l • Lymfocyty v diferenciálním rozpočtu: 0.04 - 0.99 numfr • Absolutní počet lymfocytů: 4.1 – 530.0 x 109 / l • Převaha řetězců κ : λ 145 pacientů - poměr 1.1 - 776 : 1 • Převaha řetězců λ : κ 100 pacientů - poměr 1.1 - 829 : 1

16. Přehled stavů s absolutní lymfocytózou diagnostikovaných na OKH NsP Havířov od 6/1997 do 2/2002 ( n = 249 )

17. Stavy bez absolutní lymfocytózy, s počtem lymfocytů < 4x109/l Vyšetřeno 18 pacientů bez absolutní lymfocytózy ( < 4.0x109 /l lymfocytů v periferní krvi ), u kterých vedla imunofenotypizace k dg. lymfoproliferace. Soubor pacientů: • 18 dospělých pacientů ve věku od 41 do 79 let ( průměrný věk 63.6 let ) • Poměr muži : ženy 10 : 8 • Počet leukocytů v KO: 2.5 – 14.2 x 109 / l • Lymfocyty v diferenciálním rozpočtu: 0.15 - 0.78 numfr • Absolutní počet lymfocytů: 1.1 – 4.0 x 109 / l • Převaha řetězců κ : λ 14 pacientů - poměr 2.8 – 69 : 1 • Převaha řetězců λ : κ 4 pacienti - poměr 4.4 – 86 : 1

18. Stavy bez absolutní lymfocytózy, s počtem lymfocytů < 4x109/l ( n = 18 )

19. Kazuistika č.1 B.D., M, 60 let • V dubnu 2000 náhodně zachycená extrémní leukocytóza na bázi lymfocytózy. • Krevní obraz: hemoglobin 125 g/l leukocyty 485x109/l trombocyty 96x109/l diff.: lymfocyty 0.91 numfr lymfocyty absolutně 441 x 109/l Imunofenotypizace lymfocytů (4/2000): CD 19+98.5 % SmIgM 91.5 % CD 19+/5+98.4 % SmIgD90.4 % CD 23+78.6 % CD 19+/+ 92.7 % CD 79b+82.0 % CD 19+/+ 0.3 % FMC 7+5.0 %Poměr /309 : 1 Závěr: B-CLL, skóre dle Matutes a spol. 3/5.

20. Kazuistika č.2 C.K., M, 63 let Před léčbou Po léčbě • Dg. B-CLL od 6/1997, skóre B-CLL 4/5. • Léčba nejprve chlorambucilem (Leuke- ran), poté fludarabinem ( 5 kúr, 2/2000- 7/2000) Charakteristika Před léčbou Po léčbě lymfocytů fludarabinem fludarabinem Leukocyty (109/l) 149.8 3.3 Lymf. diff.(numfr) 0.92 0.31 Lymf. absol. (109/l) 137.8 1.0 CD 19+ 87.5 % 91.2 % CD 19+/5+ 87.5 % 91.2 % CD 23+ 81.0 % 85.2 % CD 19+/+ 1.6 % 0.3 % CD 19+/+ 90.7 % 87.2 % Poměr / 57 : 1 291 : 1 Závěr: I přes leukopenii a lymfopenii není po léčbě B-CLL remise na úrovni imunofenotypu dosaženo !

21. Kazuistika č. 3 J. K., M, 42 let • V 5/2001 při preventivní prohlídce zjištěna trombocytopenie, leukocyty početně v normě, v diff. lymfocytóza. Dále splenomegalie. Cytomorfologicky některé lymfocyty s vilózními výběžky, pojato podezření na HCL. • KO v 5/2001: Hb 171 g/l leuk. 5.4 x 109/l tromb. 53 x 109/l diff.: segm. 0.14 ly 0.82, mo 0.04 numfr Imunofenotypizace patologických buněk PK: CD19 89.5% CD19+/κ+ 4.8% CD11c 94.1% CD19+/λ+ 75.6% CD22 86.7% CD25 81.6%λ : κ= 16 : 1 CD103 88.3% CD5 8.8% SmIgG 90.8% CD23 6.4% SmIgA 79.5% Závěr: Vlasatobuněčná leukémie (HCL). (Potvrzeno histologií kostní dřeně.)

22. Závěry I. • Imunofenotypizace představuje u hematoonkologických onemocnění zásadní diagnostickou a diferenciálně diagnostickou metodu. Multiparametrová analýza buněk zvyšuje přesnost diagnózy a lépe charakterizuje imunofenotyp vyšetřované populace. • Jednotlivé hematoonkologické jednotky se vyznačují poměrně charakteristickým až zcela diagnostickým imunofenotypem, který může mít i prognostický význam a jehož lze např. využít k průkazu relapsu onemocnění a monitoraci minimální reziduální choroby. • Imunofenotypizace průtokovou cytometrií se vyznačuje vysokou senzitivitou a specifitou (citlivost metody cca 10-3 buněk), rychlostí a reprodukovatelností.

23. Závěry II. • Při záchytu absolutní lymfocytózy, zejména perzistující, je nutné vyloučit monoklonální charakter lymfoidní populace. K tomuto účelu se jeví imunofenotypizace ve většině případů jako suverénní diagnostická metoda, která často objasní monoklonalitu i u lymfoproliferací s relativní lymfocytózou. • Vysoká senzitivita i specifita při stanovení imunofenotypu buněk vede často k odhalení patologického lymfoidního klonu podstatně dříve než při vyšetření dalšími běžnými metodami. • Pacient s monoklonální lymfocytózou by měl být komplexně vyšetřen. U dosud nevyhraněného imunofenotypu jsou nutné dispenzarizace a kontroly.

24. FNsP Ostrava: ÚKH Interní klinika NsP Karviná – Ráj: HTO Interní oddělení Oddělení TRN ORL oddělení Karvinská hornická nemocnice, a.s. : Interní oddělení Nemocnice Třinec : Interní oddělení HTO Krevní centrum Frýdek - Místek Nemocnice Hranice : HTO Nemocnice Frýdek – Místek : HTO Interní oddělení Urologické odd. Odd. následné péče Nemocnice Bohumín : Interní oddělení Chirurgické odd. Městská nemocnice Český Těšín : OKBH Interní oddělení Nemocnice Orlová a LDN : Interní oddělení Neurologické odd. LDN Praktičtí lékaři Spolupracující pracoviště