W celu zbadania mechanizmu dz iałania ITC wykonano nast ępujace badania:

1. CH3-SO-(CH2)4-NCS CH3-CO-(CH2)4-NCS CH3-SO-(CH2)5-NCS Izotiocyjanian 2-oksoheksylu 4-metylosulfinylo n-butyl (Sulforafan) 5-metylosulfinylo n-amyl (Alyssin) Zdrowe limfoblastoidy ludzkie Ludzkie komórki białaczki Zdrowe limfoblastoidy ludzkie Zdrowe limfoblastoidy ludzkie Próba z BSO Próba kontrolna B A E Ludzkie komórki białaczki CCRF-SB Ludzkie komórki białaczki CCRF-SB Próba z BSO Próba kontrolna H G D C SFN – Sulforafan SFC – Izotiocyjanian 2-oksoheksylu ALL - Alyssin Wraz ze wzrostem natężenia fluorescencji rośnie ilość RFT Tabela 1 WPŁYW BSO NA ZMIANY AKTYWNOŚCI ENZYMU GST BADANIE DZIAŁANIA IZOTIOCYJANIANÓW NA KOMÓRKI LUDZKIE Joanna Biedrzycka Kierownik pracy: prof. dr hab. Teresa Kasprzycka-Guttman, Opiekun pracy: dr inż. Irena Misiewicz-Krzemińska, Narodowy Instytut Leków, Warszawa Wprowadzenie Izotiocyjaniany (ITC) są grupą związków biologicznie czynnych występujących głównie w warzywach z rodziny krzyżowych m.in. brokułach, kapuście, brukse-lce, kalafiorze i innych. Zarówno in vivo, jak i in vitro wykazują one silne właściwości chemoprewentywne. Izotiocyjaniany indukują aktywność enzymów 2 fazy metabolizmu w organizmie. Enzymy te chronią komórki przed toksycznymi efektami działania elektrofili i reaktywnych form tlenu (RFT). Jednym z enzymów należących do 2 fazy jest transferaza S-glutationowa (GST). Glutation jest wewnatrzkomórkowym trój-peptydem - -GluCysGly (GSH),który bierze udział w procesach detoksykacji organizmów.Wykazano, że ITC kumulują się w komórkach głównie w postaci ko-niugatów z glutationem, Reakcja ta katalizowana jest przez transferazę S-glutationową. Celem pracy było badanie zmian poziomu glutationu (GSH) i aktywności GST pod wpływem działania trzech ITC: sulforafanu, alyssinu oraz izoticyjanianu 2-oksoheksylu. Badania prowadzono na komórkach o normalnym i obniżonym poziomie glutationu. Czynnikiem obniżajacym poziom GSH jest BSO (butioninosulfoksy-imina), który jest selektywnym inhibitorem syntezy glutationu. Sprawdzano także czy izotiocyjanian 2-oksoheksylu i alyssin działają poprzez ten sam mechanizm molekularny co sulforafan. Sulforafan wpływa na translo-kację białka Nrf2 do jądra komórowego. Tambiałko to wiaże się ze składnikami odpowiedzi antyoksydacyjnej (ARE), które są odpowiedzialne za aktywację genów kodujących enzymy 2 fazy. MATERIAŁY DO BADAŃ ILOŚĆ REAKTYWNYCHFORM TLENU WPŁYW IZOTIOCYJANIANÓW NA AKTYWNOŚĆ GST METODYKA BADAŃ F W celu zbadania mechanizmu działania ITC wykonano następujace badania: • Zbadano zmiany aktywności enzymatycznej GST dla zdrowych limfoblastoidów ludzkich oraz CCRF-SB z zastosowaniem 1-chloro-2,4-dinitrobenzenu (CDNB) jako substratu ( po inkubacjilinii komórkowych z ITC, BSO oraz ich mieszaniną) • Jednocześnie zbadanoilość reaktywnych form tlenu metodą cytometrii przepływowej z zastosowaniem dihydrorodaminy (DHR123) jako barwnika • Mechanizm regulacji aktywności enzymów, przedstawiony na schemacie, badano przy użyciu mikroskopukonfokalnego z wykorzystaniem przeciwciał skierowanych przeciwko białkom Keap1 i Nfr2 oraz odpowiednich barwników fluorescencyjnych • Wnioski • Obecność BSO w obu liniach komórkowych po czasie inkubacji 24h powoduje spadek aktywności GST, co wskazuje na niski poziom glutationu (Tabela 1) • BSO wpływa na zwiększenie ilości szkodliwych dla organizmu RFT (Rysunek A, B, C, D) • Aktywność GST rośnie wraz ze wzrostem stężenia izotiocyjanianów i wydłużaniem czasu inkubacji (Rysunek E, F, G, H) • Aktywność GST jest silniej indukowana przez ITC w komórkach ludzkiej białaczki (G, H) • Alyssin najsilniej indukuje enzym GST • Badania wstępne sugerują, że izotiocyjaniany działają poprzez ten sam mechanizm molekularny co sulforafan • Induktor - sulforafan • Keap 1 – Nrf2 – kompleks pomiędzy białkiem związanym z aktyną Keap1 a czynnikiem transkrypcyjnym Nrf2 • ARE – składniki odpowiedzi anty- • oksydacyjnej