Milieux de culture et tests biochimiques

1. Milieux de culture et tests biochimiques (Enterobacteriaceae)

2. Les tests biochimiques Oxydase Catalase Indole MR VP Citrate Nitrate Kligler Urée

3. OXYDASE But : mettre en évidence la cytochrome oxydase Principe: Le réactif TÉTRAMETHYL-P-PHENYLENEDIAMINE DIHYDROCHLORURE 1% est de couleur pourpre lorsque oxydé Technique: Sur papier filtre déposer le réactif et les bactéries Résultat: Positif : bleu-pourpre

4. Oxydase

5. Catalase But : mettre en évidence la catalase Principe: Le réactif PEROXYDE D’HYDROGÈNE 3% est décomposé en H2O + H2 par l’enzyme Technique: Sur une lame de verre déposer les bactéries ajouter le réactif Résultat: Positif : présence de bulles

6. Catalase Mettre suffisamment de bactéries Attention aux globules rouges Ne pas contaminer le réactif Jeter dans les états frais

7. ONPG But : Mettre en évidence la bêta-galactosidase sur un substrat synthétique Principe : la bêta-galactosidase va couper le lien de l’ortho-nitrophényl galactoside ce qui va libérer l’orthonitrophénol de couleur jaune

9. Indole But: Mettre en évidence la tryptophanase Principe: La dégradation du tryptophane donne de l’indole, de l’acide pyruvique et de l’ammoniac. L’indole est mis en évidence parle réactif de Kovac Réactif de Kovac’s: p-dimethylaminobenzaldehyde, HCl, alcool amylique

10. Technique: Ensemencer un bouillon riche en tryptophane. Incuber 37°C, 24 h. Ajouter le réactif. Résultat Positif: Anneau rouge

11. MR But: mettre en évidence les bactéries qui utilisent le glucose en produisant beaucoup d’acides (lactique, acétique, formique) Principe : L’indicateur ROUGE DE MÉTHYLE est rouge à pH 4.4. Une grande quantité d’acide produit après 48 heures indique que c’est la voie de dégradation du glucose en acides mixtes.

12. VP (Voges-Proskauer) But: Mettre en évidence la production d’acétyl-méthyl-carabinol (acétoïne) à partir de la dégradation du glucose Principe: La présence d’acétoïne indique que la bactérie utilise cette voie de dégradation du glucose. Le réactif alpha-naphtol met en évidence l’acétoïne

13. MR Rouge de méthyle VP Alpha-naphtol et KOH Réactif

14. MR - VP

15. Citrate But: Vérifier si la bactérie peut utiliser le citrate comme seule source de carbone Principe: Le milieu contient le citrate comme source de carbone et le phosphate d’ammonium comme source d’azote. Lorsque la bactérie utilise le C et le N le pH du milieu deviendra alcalin. L’indicateur bleu de bromothymol passera de vert à bleu.

16. Citrate Citrate: source de C Phosphate d’ammonium : source de N Indicateur: Bleu de bromothymol Incubation: 24-48h

17. IMViC

18. Nitrate But: Mettre en évidence l’enzyme nitrate réductase (nitrate NO3 en nitrite NO2) Principe: Milieu riche en nitrate. La présence de nitrite est révélée par l’addition des réactifs. Réactif: acide sulfanilique (A) N, N-diméthyle-naphthylamine (B) . Si négatif, l’addition de Zn réduit les nitrates.

19. Résultats Nitrate + :rouge après addition des réactifs. Si incolore après addition des réactifs, ajout de Zn Nitrate - : Rouge après addition du Zinc Nitrate + : incolore après addition de Zinc

20. Kligler But: Mettre en évidence l’utilisation du glucose, du lactose et la production de H2S Principe: Le milieu contient 10 fois plus de lactose que de glucose, un indicateur pH le rouge de phénol et un sel de fer pour détecter le H2S

21. Lecture des résultats Culot = Glucose Pente = Lactose Résultats: Pente / culot Acide = A Alcalin = K Gaz = G

22. Résultats C = Contrôle 2 = Glucose + lactose – 3 = Glu +, Lac -, H2S + 4 = Glu +. Lac +, Gaz + 5 = Glu +, Lac + H2S +

23. Urée But:Mettre en évidence l’uréase Principe: L’urée du milieu est hydrolysée et donne de l’ammoniac. Le carbonate d’ammonium produit hausse le pH et change l’indicateur pH est le rouge de phénol.

24. Résultat

25. APP (acide phényl pyruvique)TDA (tryptophane-phénylalanine désaminase) But: Mettre en évidence la phénylalanine désaminase. Principe: Détection de l’acide phényl pyruvique libéré par l’action de la désaminase sur l’acide aminé. Réactif: Chlorure ferrique

26. Résultats Milieu riche en phénylalanine Réactif : Chlorure ferrique A = - B = + vert intense

27. Décarboxylase But : mettre en évidence les décarboxylases des acides aminés. Principe: Les décarboxylase libère du CO2 ce qui alcalinise le milieu. L’indicateur pH est le bromecrésol pourpre. Utilisation du glucose, le milieu devient acide. Décarboxylation, le milieu redevient basique. Témoin sans acide aminé.

28. Lysine -> cadavérine Ornithine -> Putrescine Arginine -> Putrescine

29. Gélatinase But: Détecter la présence de l’enzyme gélatinase Résultat positif: Liquéfaction de la gélatine

30. Milieux de culture Mac Conkey Gélose SS Gélose mobilité

31. MacConkey Sélectif: sels biliaires, cristal violet Gram négatif Différentiel: lactose Indicateur: Rouge neutre

32. Gélose SS (Salmonella / Shigella) Sélectif: sels biliaires, vert brillant, forte concentration en citrate de sodium. Diférenciel: lactose et thiosulfate (H2S). colonies rouges : lact + incolores : lac – centre noir : H2S +

33. Mobilité Milieu en boîte ou en tube % d’agar réduit Diffusion à partir du point d’inoculation

34. Mobilité

35. Microméthodes Galeries API Microbac 12 A et 12 B Enterotubes

36. API

37. Entétotubes Microméthode 12 tests

38. Microbac

39. Références http://medic.med.uth.tmc.edu/path/methods.htm http://www.techmicrobio.net/systematique/GramNegatif/Enterobacteries/Enterobacteries.html http://smccd.net/accounts/case/biol240/citrate.html http://smccd.net/accounts/case/biol240/NO.html http://www.jlindquist.net/generalmicro/dfkiaandmio.html http://www.marietta.edu/~spilatrs/biol202/labresults/motility.html http://py.guillaume1.free.fr/site%20microbiologie/page%20les%20milieux%20de%20culture/milieu_boite.htm#SS