1 / 46

Metody molekulární biologie

Metody molekulární biologie. Centrifugace a ultracentrifigace frakční rychlostní gradientová rovnovážná sedimentace. Autoradiografie. Rentgenová krystalografie. Chromatografie rozdělovací iontoměničová afinitní. NMR spektroskopie. Elektroforéza SDS-PAGE Dvourozměrná

ewa
Download Presentation

Metody molekulární biologie

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Metody molekulární biologie Centrifugace a ultracentrifigace frakční rychlostní gradientová rovnovážná sedimentace Autoradiografie Rentgenová krystalografie Chromatografie rozdělovací iontoměničová afinitní NMR spektroskopie Elektroforéza SDS-PAGE Dvourozměrná isoelektrická fokusace SDS-PAGE DNA technologie

  2. DNA technologie

  3. DNA technologie Elektroforéza DNA Sekvenace DNA Pyrosekvenace Transformace bakterií cizorodou DNA Skrínink bakteriálních kolonií DNA microarrays - DNA čipy CGS sekvenace Klonování DNA Restrikční endonuklázy Ligace fragmentů DNA Klonovací vektory Vektory pro idetifikaci promotorů In vitro mutageneze Transpozonová mutageneze Mutageneze pomocí DNA oligonukleotidů Příprava DNA knihovny Denaturace a renaturace DNA FISH – hybridizace in situ PCR amplifikace

  4. Elektroforéza DNA Štěpení restrikčními enzymy Rozdělení fragmentů v agarózovém gelu Detekce pomocí etidium bromidu a UV záření

  5. Transformace bakterií cizorodou DNA

  6. Transformace a produkce velkého množství rekombinantní DNA

  7. Skrínink bakteriálních kolonií obsahující požadovanou sekvenci DNA

  8. Restrikční endonuklázy a restrikční štěpení DNA

  9. Ligace fragmentů DNA

  10. Klonování DNA

  11. Klonování z několika fragmentů DNA

  12. Klonovací vektory

  13. s54 fhlA s54 - závislý promotor Photorhabdus luminescens Vektory pro idetifikaci promotorových sekvencí RCOOH FMNH2 + RCHO + O2 FMN + H2O + RCOOH + hn (490 nm)

  14. In vitro transpozonová mutageneze

  15. In vitro transpozonová mutageneze TP0422 TP0423 TP0424 TP0425 TP0426 TP0427 TP0428 TP0429 TP0430 TP0431 TP0432 TP0433 TP0434

  16. Mutageneze pomocí DNA oligonukleotidů

  17. Příprava DNA knihovny

  18. Denaturace a renaturace DNA

  19. Denaturace a renaturace DNA

  20. FISH – hybridizace in situ

  21. PCR amplifikace

  22. PCR amplifikace

  23. PCR v reálném čase

  24. Sekvenace DNA

  25. Sekvenace DNA

  26. Pyrosekvenace

  27. Pyrosekvenace

  28. Přístroj pro pyrosekvenaci Člověk – šimpanz - 99% identita Člověk – Neandertálec (400.000 – 30. 000 let) – 99,96% identita

  29. DNA microarrays - DNA čipy Regulation of lac transcription

  30. Značení DNA pro techniku DNA microarrays

  31. DNA microarrays

  32. Vyhodnocení dat z DNA microarray experimentu

  33. Komparativní genomová sekvenace na čipech (NimbleGen) 29-mery (s 22bp překryvem) DNA 2 x 162 574 hybridizací na čip Fáze I. Každý nukleotid je detegován 8 oligonukleotidy Fáze II. Sekvenační čip DNA DNA sekvenace

  34. Digital Micromirror Device (DMD) Up to 386.000 features per chip Syntéza oligonukleotidůin situNimbleGen Systems Inc.

  35. Výsledky CGS sekvenace

  36. CGRadvantages/disadvantages • sequencing of similar genomes • rapid – data in days to weeks • lower costs – $4,000 per 1.5 Mb • up to 386.000 features per array – up to 1.5 Mb • hypervariableregions+ non-unique sites of the genome – need to be sanger sequenced • length of sanger sequenced regionssignificantly reduced(100x in case of SS14) => simplified „assembly“ • can map deletions, but insertions ???

  37. Reliability of results • randomly chosen regions – 35.5 kb • 50 SNPs verified (50/213 CGR found) • no false positives • false positives rate – lower than 2.5 x 10-5 • false negatives – 1 SNP, 4 1nt indels • false positives rate – lower than 1.4 x 10-4 • comparable to DDT sequencing

More Related