1 / 39

Zastosowanie kalorymetrii ITC w badaniach białek

Zastosowanie kalorymetrii ITC w badaniach białek. Katarzyna Breer. Kalorymetria, czyli ,,mierzenie ciepła’’. DSC (differential scanning calorimetry) ITC (isothermal titration calorimetry). www.microcal.com. 81 m M domena SH2 Lck ligand 0.4mM fosfopeptyd TEGOqYQPQPA.

feo
Download Presentation

Zastosowanie kalorymetrii ITC w badaniach białek

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Zastosowanie kalorymetrii ITCw badaniach białek Katarzyna Breer

  2. Kalorymetria, czyli ,,mierzenie ciepła’’ • DSC (differential scanning calorimetry) • ITC (isothermal titration calorimetry) www.microcal.com

  3. 81 mM domena SH2 Lck ligand 0.4mM fosfopeptyd TEGOqYQPQPA T – const, p – const Leavitt and Freire 2001 Current Opinion in Structural Biology

  4. Warianty metody • Enzym/substrat/inhibitor • Single injection • Dysocjacja (dimeru)

  5. Kalorymetr ITC VP-ITC • Objętość celki ~1.4 ml • Objętość strzykawki ~ 270ml • Peltier 2-800C • Szum 0.5 ncal/s

  6. DQL=DHL DHcal DQML=DHML Jakie informacje można uzyskać z krzywej miareczkowania ITC? Miareczkowanie ~8 mM PNP (cielęce) Guaniną 20 mM Hepes pH 7.0, 250C

  7. [L]t = [L] + n[M]t Identyczne, nieoddziałujące miejsca wiązania  – frakcja miejsc zajętych 1-  – frakcja miejsc wolnych Q = n[M]t ·V0DHML

  8. Parametr sigmoidalności C = Ka [M]t 10 < C < 1000 Ka ~108 – 109 M-1 Wiseman et al. 1989

  9. Proteaza HIV-1 KA ~KB Leavitt and Freire 2001

  10. Wiązanie kompetycyjne Słaby inhibitor Silny inhibitor DQ(i) = V0 [M]t (DHADA(i) + DHBDB(i)) Sigurskjold 2000

  11. Energia chemiczna Proces spontaniczny dG  0 Parametry termodynamiczne U(S,V,N) = TS – pV + SmN dU (S,V,N) = TdS – pdV + SmidNi Naturalne zmienne ITC to (T,p,N) G (T,p,N) = U – TS + pV = SmiNi dG (T,p,N) = –SdT + Vdp + SmidNi

  12. Wiązania wodorowe Oddziaływania van der Waalsa Oddziaływania elektrostatyczne Solwatacja Wewnętrzne stopnie swobody Związek entalpii, entropii i energii swobodnej Gibbsa G = U + pV – TS = H – TS dG = dH – TdS Wkład entropowy Wkład entalpowy (cieplny)

  13. ~8 mM PNP ~0.2 mM PNP N = 0.5  0.1 Ka = (11.3  0.9) 106 M-1 N = 0.6 Ka = (4.9  0.4) 106 M-1 DHcal = -14.2  0.1 kcal/mol TDS = -5.0 kcal/mol 250C, 20 mM Hepes pH 7.0 DG = -RTln Ka

  14. [M]t = 0.92 mM [M]akt = 0.96 mM Ka = (5.3  2.5) 109 M-1

  15. Niezależnie wiążące miejsca Miejsca oddziałujące – kooperacja Zachowania nieszablonowe [L]t = [L] + [M]t(n11DH1+n22DH2) Q = [M]tV0(n11DH1 + n22DH2)

  16. Miareczkowania PNP ligandem DFPP-DG N1 = 0.8 K1 = (6.7  6.4 ) 1010 M-1 DH1 = -6.3  0.05 kcal/mol TDS1 = 8.2 kcal/mol N2 = 0.2 K2 = (3.1  2.8) 108 M-1 DH2 = 5.8  0.2 kcal/mol TDS2 = 17.6 kcal/mol N = 1.0 Ka = (1.2  0.5) 109 M-1 DH = -5.7  0.04 kcal/mol TDS = 6.6 kcal/mol 20 mM Hepes pH 7.0, 200C

  17. Ka Entalpia van’t Hoff’a Izobara van’t Hoff’a Analiza van’t Hoff’a

  18. Ka Entalpia van’t Hoff’a

  19. Forma całkowa izobary van’t Hoff’a Polimeraza Klenowa Datta et al., 2006

  20. Napędzana entropowo TH Napędzana entalpowo TS DCp ~ - (0.9 – 1.2) kcal/(mol K)

  21. Zależność DHcal(T)dla wiązania DFPP-DG przez PNP • DCp – const. • DCp = -0.202  0.031 kcal/(mol K)

  22. Kas ~109-1011 M-1 Poza zakresem pracy metody Zależność Kas (T)

  23. N = 0.9 Ka = (1.4  0.1) 107 M-1 DH = -12.0  0.1 kcal/mol TDS = -2.4 kcal/mol N1 = 1.0 K1 = (0.2  1.7) 1011 M-1 DH1 = -6.2  0.1 kcal/mol TDS1 = 7.6 kcal/mol N2 = 0.1 K2 = (0.4  3.0) 109 M-1 DH2 = 9.6  2.6 kcal/mol TDS2 = 1.7 kcal/mol  ligand Guanina

  24. Zmiany entropii i entalpii DH (T) = DHconf (T) + DHintrinsic (T) DS (T)= DSsolv (T) + DSconf (T) + DSinne(T) DSsolv (T) = DCpln(T/TS)

  25. ASAsolvent accessible surface area DH = DHconf + a(T)·DASAap + b(T) ·DASApol DCp ap < 0 DCppol > 0 Luić et al. 2004

  26. Kompleksy białko – białko Fab E8 cytochrom c oraz przeciwciało E8 DCp ~ - (0.2 – 0.6) kcal/(mol K) Mylvaganam et al., 1998

  27. DHcal – DHvH = const

  28. Miareczkowania proteazy HIV-1 indivinavirem Todd et al., 2000 Przepływ protonów DHapp = DHbind + nH+DHion • Acetate 0.1 kcal/mol • MES 3.7 kcal/mol • ACES 7.5 kcal/mol

  29. Kconf jedna forma wiąże obie formy wiążą ligand K0 K1 DCp app log Kconf Równowaga dynamiczna Eftink et al., 1983

  30. Temperature Kompleksy białko – DNA Dragan et al., 2004

  31. 4·109 M-1 5·1010 M-1 9·1010 M-1 1011 M-1 Jak projektować inhibitory?

  32. 130x 15x 25x 40x Mutant V82F/I84V Muzammil et al., 2007

  33. MDR mutant 700x 50x 20x 20x

  34. Allosteria ,,entropowa” Białko CAP

  35. Na podstawie widm NMR 2D 1H-15N HSQC BRAK ZMIAN KONFORMACYJNYCH

  36. ms – ms powolne ruchy domen

  37. Podziękowania dla: Romana Szczepanowskiego Matthias’a Bochtler’a

  38. Energie wiązań: Elektrostatyczne w wodzie ~1A 20kJ/mol Wodorowe 4-25 kJ/mol Hydrofobowe 4 kJ/mol van der Waalsa 0. 5 kJ/mol • DS > 0 woda została wypchnięta z powierzchni kompleksu • DS < 0 może mieć wiele przyczyn i nie koniecznie znaczyć, że hydratacja wzrosła, bądź się nie zmieniła

More Related