Meccanismi di tossicità

1. Meccanismi di tossicità MeccanismiMeccanismi specificinon specifici Tossine animali Composti organici Composti e vegetali di sintesi inorganici Farmaci

2. Meccanismi specifici • Interazione selettiva con specifiche proteine (enzimi, canali ionici, trasportatori ecc.)  danneggiamento di funzioni cellulari specifiche  tossicità cellulare e/o d’organo. • In genere legame non covalente. • Razionale biologico?: selezionate sostanze non tossiche per l’organismo che le produce; a scopo difensivo, l’effetto tossico deve essere intenso e manifestarsi a breve termine.

3. Meccanismi non specifici • La sostanza o un suo metabolita reattivo (es.: radicale libero, elettrofilo), reagiscono in modo aspecifico con diversi componenti cellulari (proteine, lipidi, acidi nucleici). • Si formano o si rompono legami covalenti (formazione di addotti; ossidazioni; sottrazione di atomi). • Ciò causa alterato funzionamento o distruzione dei componenti cellulari colpiti  tossicità cellulare  tossicità di organo/sistema. • In genere, non è chiaro quali dei numerosi siti di attacco cellulare siano responsabili dell’effetto tossico.

4. Questo tipo di meccanismo è dovuti quasi sempre alla formazione di metaboliti reattivi e non alla sostanza tal quale. • Perché?

5. Alcune sostanze modificano la composizione dei fluidi biologici: • pH (acidi e basi); • composizione ionica (sali, chelanti); • cofattori enzimatici (deplezione, malassorbimento) • concentrazione di metaboliti intermedi (stimolazione o inibizione di vie metaboliche; es.: porfiria, steatosi) Queste alterazioni causano tossicità cellulare e/o d’organo.

6. N.B.: oltre a tossine che agiscono in modo selettivo, i vegetali contengono anche molti composti che danno tossicità con meccanismo non specifico. Molti farmaci e alcuni altri composti organici di sintesi danno tossicità con meccanismo specifico.

7. Tipi di tossicità • Tossicità funzionale: alterazioni delle funzioni di un sistema (nervoso, cardiovascolare, endocrino)  possibile danno d’organo. • Citotossicità: alterazione irreversibile di proteine (enzimi, canali ionici ecc.) o membrane (lipidi); disregolazione del metabolismo  necrosi, apoptosi  tossicità tissutale e d’organo o sistema (fegato, rene, SNC ecc.). • Genotossicità: alterazione del DNA  mutazioni, alterazioni cromosomiche  cancerogenesi, malattie congenite. • Reazioni allergiche: allergeni, apteni, modificatori degli antigeni cellulari  risposta immunitaria.

8. 1. Alterazione delle normali funzioni cellulari senza danno cellulare primario diretto (tossicità ‘funzionale’)  tossicità d’organo o sistema (tossicità cellulare secondaria) Esempi: • Una sostanza che provochi vasodilatazione (es., alfa1-bloccante, agonista istaminergico) non causa danni diretti ai vasi ma provoca ipotensione e riduzione del flusso ematico  danni cerebrali, renali ecc Una sostanza che causa contrazione della muscolatura vasale (es. agonista adrenergico) non danneggia i vasi ma causa  tossicità cardiaca, cerebrale, renale.

9. Una sostanza che stimoli il rilascio di insulina dalle cellule pancreatiche (senza danneggiarle) causa ipoglicemia e tossicità a carico del sistema nervoso centrale (danno neuronale indiretto) • Una sostanza antagonista degli ormoni sessuali può causare tossicità riproduttiva senza causare danno diretto alle cellule dell’apparato riproduttivo

10. Danno cellulare (citotossicità). • L’alterato funzionamento o la distruzione della macromolecola bersaglio provoca una danno cellulare • L’entità di tale danno dipende da: • importanza della funzione del componente cellulare colpito • capacità di riparazione da parte della cellula (rimozione dei componenti danneggiati e loro sostituzione )

11. citotossicità • Se il danno è irreversibile e/o esteso e/o coinvolge componenti cellulari essenziali, si ha la morte cellulare (necrosi). • Nella maggior parte dei tessuti, le cellule morte possono essere sostituite da cellule dello stesso tipo (divisione cellulare)  riparazione totale del danno. N.B.: i neuroni non possono replicarsi. • Se l’area necrotica è estesa, si ha infiammazione e formazione di tessuti connettivi di riparazione (tessuti cicatriziali)  riparazione parziale del danno (la funzionalità dell’organo è diminuita o alterata).

12. citotossicità • Se l’insulto cellulare non è ‘grave’, si può avere alterazione del metabolismo della cellula senza morte cellulare. • In questi casi si possono avere alterazioni di: • dimensioni cellulari (atrofia o ipertrofia) • proliferazione e differenziazione cellulare (iperplasia, metaplasia) • accumulo di componenti cellulari (es. steatosi epatica)

13. citotossicità La morte cellulare può avvenire per necrosi o per apoptosi

15. citotossicità

16. citotossicità Siti di attacco cellulare • Membrane: • Lipidi: perossidazione • Proteine: enzimi, canali, pompe, trasportatori: alterazione della funzionalità

17. citotossicità: danno alle membrane Perossidazione lipidica • Avviene ad opera di radicali (liberi): meccanismo non specifico • Dato che i radicali hanno molti altri punti bersagli cellulari (proteine, DNA), il suo ruolo nel danno cellulare in molti casi non è ben definito (causa o effetto?)

20. La perossidazione porta alla distruzione dei lipidi  alterazione della struttura della membrana  alterazioni della funzionalità. I lipidi ossidati possono a loro volta ossidare le proteine di membrana. La formazione di radicali può danneggiare strutture distanti dal sito iniziale d’attacco.

21. Nella perossidazione lipidica si formano prodotti di degradazione; • questi sono utilizzati per misurare il grado di perossidazione; in genere si misura la formazione della malonildialdeide (dialdeide malonica)

22. CCl4

23. GSH-Px(u/mg protein) MDA(nmol/mg protein) Control 45.4±5.9 4.15±0.5 CCl4 34.5±3.1* 5.55±0.7* CCl4+Interferon 46.5±6.4** 4.27±0.3** Esempio; valutazione dell’effetto ossidativo in ratti trattati con CCl4 (s.c.) per 7 settimane Oxidative stress markers Mean renal MDA (malondialdehyde)and GSH-Px (glutathione peroxidase)levels in the control, CCl4 and CCl4+INF groups *p<0.01 vs. control, **p>0.05 vs. control.

24. citotossicità Sbilanciamento dei sistemi redox cellulari • La cellula ha numerosi sistemi redox, necessari al corretto metabolismo (GSH/GSSG, NAD/NADH, NADP/NADPH, piruvato/lattato ecc.). • L’attività di molte proteine (enzimi, fattori di trascrizione ecc.) è regolata dallo stato redox della cellula.

25. Regolazione dell’attività di una monoossigenasi flavinica da parte dello stato redox (GSH/GSSG)

26. Figure 1. Diagram of the NF-kB activation pathway indicating the steps where there is evidence for direct modulation by reactive oxygen species (ROS)

27. La diminuzione di GSH comporta, tra l’altro, una diminuita protezione nei confronti dell’ossidazione dei tioli proteici  alterazioni strutturali e funzionali. • La detossificazione di ossidanti e radicali comporta un consumo di equivalenti riducenti ed un conseguente sbilanciamento dei sistemi redox  alterazioni del metabolismo cellulare.

28. citotossicità • L’alterazione dei sistemi redox può anche causare effetti tossici indirettamente. • Es.: la detossificazione di H2O2 da parte della glutatione perossidasi porta alla formazione di glutatione ossidato (GSSG); la rigenerazione di glutatione ridotto ad opera della glutatione reduttasi comporta il consumo di NADPH  alterazione del rapporto NAPD/NADPH  alterazione di molte funzioni cellulari (es. efflusso di Ca++ dai mitocondri).

30. citotossicità • Anche lo sbilanciamento verso lo stato ridotto altera il metabolismo. • Ad esempio, l’etanolo viene ossidato in due stadi ad acetato: • etanolo + NAD  acetaldeide + NADH • acetaldeide + NAD  acetato + NADH • Negli alcolisti si ha quindi una sovrapproduzione di NADH, che favorisce la riduzione di piruvato a lattato e di ossalacetato a malato, diminuendo così la gluconeogenesi. • Il risultato finale è una condizione di ipoglicemia.

32. citotossicità Disregolazione metabolica. Principali meccanismi • Inibizione del metabolismo energetico (produzione di ATP) • Aumento del Ca++ libero intracellulare • Alterazione della sintesi di macromolecole (acidi nucleici, proteine)

33. citotossicità • Inibizione della produzione di ATP • Può avvenire per blocco della glicolisi (es. iodoacetato) o della respirazione mitocondriale (es., cianuro, disaccoppianti)

34. Il gradiente di H+ viene utilizzato per generare ATP. I disaccoppianti provocano un trasporto di H+ passivo attraverso la membrana  inibizione della sintesi di ATP.

35. CN- si lega al Fe+3 del gruppo eme  blocco del flusso degli elettroni

36. citotossicità • Inibizione totale  necrosi cellulare • Inibizione parziale e/o temporanea  riduzione del metabolismo, ridotta capacità rigenerativa, aumentata sensibilità a stimoli tossici

37. citotossicità • Aumento del Ca++ intracellulare • La concentrazione di Ca++ intracellulare libero è strettamente regolata poiché Ca++ è necessario per l’attività di molti enzimi (proteasi, fosfolipasi, endonucleasi ecc.) e regola molte attività cellulari • Sostanze che danneggiano i sistemi responsabili del mantenimento della concentrazione di Ca++ provocano un suo aumento con attivazione di molti enzimi litici e conseguente morte cellulare (necrosi o apoptosi).

38. proteasi Ca-dipendenti proteasi lisosomiali

39. Sinergismo in tossicologia Molto importante per esposizione contemporanea a molte sostanze diverse. L’esposizione ad una sostanza, in modalità non tossiche, determina un aumento della tossicità di una seconda sostanza

40. Acetaminophen Overdose • Dose related toxicity in low risk patient: • < 125 mg/kg (8.75 g in 70 kg person) - rare liver toxicity • >250 mg/kg (17.5 g) considered "minimum hepatotoxic dose" • > 350 mg/kg (24.5 g) -- invariably severe liver damage • High risk patient: • In chronic ethanol abusers, hepatic necrosishas been reported with short-term use of paracetamol dosages of 2.5 g/day. Fatalities have occurred.

42. Reazioni allergiche e autoimmuni indotte da metaboliti reattivi • Diverse sostanze possono modulare in modo aspecifico il sistema immunitario, determinando immunosoppressione (più comune)o immunostimolazione generalizzata (più raro, es.; silicosi, esaclorobenzene) • Molte sostanze si comportano da allergeni o apteni, inducendo una risposta immunitaria  reazioni allergiche (Tipo I-IV). • I metaboliti reattivi di alcune sostanze si legano covalentemente ad alcune proteine, modificandone le caratteristiche immunitarie  malattia autoimmunitaria (es. epatite da alotano).

43. Formazione di composti tossici in vivo. Meccanismi di detossificazione • Formazione di radicali. • Per ossidazione di fenoli, idrochinoni, amine, idrazine. tioli ecc. da parte di CYP450 o perossidasi: R  R.+ + 1e si forma una radicale cationico, che può sottrarre un atomo di idrogeno a lipidi ed altre molecole (proteine, DNA, glutatione ecc.). • Per scissione omolitica di un legame C-H; es: CCl4 subisce dealogenazione riduttiva ad opera di CYP450; si forma il radicale triclorometilico CCl3.

44. Per riduzione ad opera della CYP450 reduttasi (e altre reduttasi): R + 1e  R.- (radicale anionico); es.: doxorubicina, nitrofurantoina. • I radicali anionici cedono il loro elettrone spaiato all’O2, formando cosi l’anione superossido: R.- + O2  R + O2 .-

45. L’anione superossido viene trasformato dalla superossido dismutasi (SOD) in perossido di idrogeno (H2O2); H2O2 (un ossidante) viene detossificato dalla catalasi: H2O2 H2O + ½ O2 Tuttavia, la formazione di anione superossido e/o di perossido di idrogeno può superare le capacità detossificanti di SOD e catalasi. H2O2 può ricevere un elettrone da ioni metallici (Fe++, Cr(V) ecc.), formando il radicale ossidrile (reazione di Fenton): H2O2 OH. + OH- Il radicale OH. è estremamente reattivo e non può essere inattivato dagli antiossidanti

46. Anione superossido, perossido di idrogeno e radicale ossidrile vengono definiti ROS (Reactive Oxygen Species)

47. I ROS sono prodotti continuamente nel nostro organismo. Ad esempio la reazione: • Hypoxanthine + O2 <=> Xanthine + H2O2 • (catalizzata dalla xantina ossidasi) genera perossido di idrogeno • I ROS prodotti dalle cellule fagocitarie svolgono un ruolo nella difesa dagli agenti infettivi. • I radicali possono danneggiare anche proteine (principalmente ossidazione dei tioli) e DNA

48. Meccanismi di detossificazione dei ROS Protezione enzimatica Glutatione perossidasi H2O2 + 2 GSH H2O + GSSG Glutatione ridotto Glutatione ossidato

49. Altri meccanismi di detossificazione dei radicali Il glutatione ridotto (GSH) reagisce con i radicali, cedendo un elettrone; si forma così il radicale tiilico GS. (relativamente stabile); l’unione di 2 radicali GS. porta alla formazione di glutatione ossidato (GSSG), che viene poi ridotto dalla glutatione reduttasi (NADPH-dipendente)

50. Antiossidanti • Vitamina E (alfa-tocoferolo), vitamina C (acido ascorbico) ed altri antiossidanti (es.: ß-carotene) reagiscono con i radicali liberi, cedendo un elettrone e trasformandosi in radicali ‘stabili’ o detossificati dai sistemi enzimatici.