ESTUDO DA PRODUÇÃO DE RESVERATROL A PARTIR DE Botrytis cinerea EM UVAS MERLOT DE SANTA CATARINA

1. ESTUDO DA PRODUÇÃO DE RESVERATROL A PARTIR DE Botrytis cinerea EM UVAS MERLOT DE SANTA CATARINA Programa Unisul de Iniciação Científica - PUIC Autora: Ariane Lumertz Francisco - Orientadora: Dra. Denise Moritz – Programa Unisul de Iniciação Científica (PUIC) - Curso: Farmácia - Campos: Tubarão INTRODUÇÃO RESULTADOS E DISCUSSÃO A busca de compostos com atividades terapêuticas benéficas vem sido intensificada, impulsionando pesquisas por novas substâncias capazes de satisfazer tais necessidades, levando à identificação de novos fármacos que possam ser empregados em diversos tipos tratamentos. Dentro deste contexto a molécula de resveratrol obtém um grande enfoque, possuindo diversas ações bioquímica e fisiológicas tendo um amplo espectro de benefícios à saúde. (AGGARWALL; SHISHODIA; AGGARWAL, 2006). O resveratrol é um composto fenólico pertencente à classe dos estilbenos. Está presente em diversas fontes da dieta humana, tais como frutas, vegetais, chás e vinhos. As uvas são consideradas uma das maiores fontes quando comparadas a outras frutas e vegetais. Sabe-se que a produção de resveratrol é estimulada em maior concentração nas variedades de Vitis vinifera das uvas por ataque de fungos (Botrytis cinérea), sendo considerado um marcador bioquímico para a resistência a Botrytis cinérea, por stress e por radiação ultravioleta. Assim, a produção do resveratrol nas plantas pode ser considerada parte do mecanismo de defesa. (ARSEGO, 2004). Uma série de trabalhos vem sendo realizados buscando desenvolver métodos que permitam otimizar sua obtenção de maneira natural (engenharia genética) ou sintética. Isso faz com que um possível medicamento produzido com resveratrol possa ser barato e, portanto, acessível às populações menos favorecidas. De fato, esta abordagem já é uma realidade em países do primeiro mundo, onde o resveratrol é comercializado sob a forma de comprimidos como antioxidante e complemento alimentar (NICHOLSON, et al., 1995). Desta forma, tornam-se promissores novos campos de pesquisa no desenvolvimento desta molécula para o tratamento e a prevenção de várias doenças, aumentando assim a expectativa de vida humana. Cabe aqui ressaltar que trata-se de um trabalho inovador, pois ainda não havia nesta universidade (UNISUL) estudos com o resveratrol, principalmente sua quantificação em cromatografia gasosa, revelando resultados surpreendentes e contradizendo relevantes referências bibliográficas, apresentando deste modo novos e promissos caminhos de pesquisa desta surpreendente molécula. O foco principal deste trabalho foi estudar a produção de trans-resveratrol por indução de uma linhagem selvagem de Botrytis cinerea em cultivo submerso utilizando a uva ou partes dela (casca, semente ou polpa). O controle microbiológico destes ensaios também foram investigados. Neste estudo, foi comparada a presença do trans-resveratrol em uvas sãs e uvas contaminadas com Botrys cinerea (Figura 2a). Também foi realizada a análise microbiológica das uvas, evitando assim a contaminação da fruta por outros microrganismos indesejáveis, uma vez que, a contaminação deveria ser induzida apenas pela espécie Botrys cinerea. As amostras utilizadas foram uvas do cultivar Merlot (vitis vinifera) coletadas na safra de 2008 do lote 09 de uma vinícola do planalto catarinense, situado no município de São Joaquim-SC. A quantificação do resveratrol foi feita através da cromatografia gasosa (CG) do mosto (uvas sãs e inoculadas), e partes das uvas (casca, polpa e semente) inoculadas com Botrys cinerea. Detecção e registro de fungos filamentosos observados: Etapas de retirada de amostras para dosagem de resveratrol após inoculação das uvas ou parte delas com Botrytis cinerea. Incubação inicial por 24 horas em estufa 25 0C e incubação em shaker orbital por 15 dias à temperatura de 25 0C ao abrigo da luz. Amostragem e detecção de trans-resveratrol Figura 4 - evolução do trans-resveratrol por cromatografia gasosa na casca das uvas, polpa e semente de sem a inoculação com o fungo Botrytis cinerea (Figura 4b, 4c e 4d, respectivamente) em comparação com a curva padrão de resveratrol (Sigma – Aldrich) (Figura 4a). OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral - Estudar a produção de resveratrol por indução de estresse em uvas Merlot colhidas de vinícolas catarinenses do Planalto Catarinense. 2.2 Objetivos Específicos - Quantificação do resveratrol através de análises de cromatografia gasosa em uvas sãs e suas partes isoladas (casca, polpa e semente), da variedade Merlot do Planalto Catarinense. - Quantificação do resveratrol através de análises de cromatografia gasosa em uvas, e suas partes isoladas (casca, polpa e semente), da variedade Merlot do Planalto Catarinense após inoculação do fungo Botrytis cinerea. Figura 5 – Evolução da concentração de trans-resveratrol na casca de uvas sãs e uvas inoculadas com Botrytis cinerea. Métodos Analíticos As amostras em estudo foram uvas da variedade Vitis vinifera “Merlot” A condução dos experimentos foi realizada em 5 etapas: 1– Coleta, armazenamento e transporte. 2 - Processamento de preparação das amostras: Separação manual do caroço, casca, polpa. 3 - Cultivo dos bagos de uvas em meio BDA para isolamento do fungo Botrytis cinerea. 4 - Sanitização de parte das amostras separadas na etapa 2 com hipoclorito de sódio 2% por uma hora para posterior inoculação. 5 – Análise de trans-resveratrol das uvas ou parte delas antes e após inoculação com a espécie de fungo isolado na etapa 3. METODOLOGIA e Conforme demonstra a Figura 5, a concentração máxima de resveratrol nos ensaios realizados por cromatografia gasosa atingiu 6,53 mg/L de trans-resveratrol, concentração mais elevada que nos ensaios realizados por cromatografia de alta eficiência (4,49 mg/L) em trabalho de conclusão de curso apresentado ao curso de Farmácia (2007). Figura a: Amostras uvas da variedade Vitis vinifera “Merlot” contaminadas. CONCLUSÃO Figura e: incubação em shaker orbital por 15 dias à temperatura de 25 0C ao abrigo da luz. b A técnica de cromatografia (CG) mostrou-se eficaz na detecção da molécula de trans-resveratrol, apresentando resultados comparáveis às técnicas de cromatografia de alta eficiência (CLAE). Cabe ressaltar que não se pode comparar neste trabalho as duas técnicas principalmente pela diferença de safra, colheita, o sistema de condução técnicas de manejo de vinhedo, luz, bem como condições operacionais, etc. A avaliação das amostras no que concerne às concentrações de resveratrol indicaram a ocorrência de valores insatisfatórios com a indução da espécie desejada (Botrytis cinerea). Contudo, faz-se necessária uma investigação detalhada de outros parâmetros que podem ter influenciado influenciar a qualidade dos vinhos, suco de uva e seus derivados, tais como a procedência da uva, o microclima na área de cultivo, o tipo de solo onde a uva foi plantada, a ocorrência de doenças fúngicas nos parreirais a cada ano, as práticas enológicas aplicadas e o tempo de permanência dos vinhos das diversas safras nas barricas de carvalho. f Figura b: cromatógrafo CG-90 com detector de ionização de chama (DIC ar-hidrogênio), injetor manual e coluna HP-1 (Crosslinked Methyl siloxane 30 m X 0,53 mm x 1,5 µm) acoplado a um microcomputador. Figura f: Cultivo de casca de uva “Merlot” em frasco Erlenmeyer inoculado com B. cinerea. d g c AGGARWALL, B. B., SHISHODIA, S. e AGGARWAL, A. B. Resveratrol in Health And Disease. , 2006. . New York: CRC Press. 2006. 679p p. ARSEGO, J. L. 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