Aspectos a tener en cuenta en el análisis de residuos de plaguicidas en vegetales por LC/MS/MS

1. Aspectos a tener en cuenta en el análisis de residuos de plaguicidas en vegetales por LC/MS/MS F. Mocholí Seminarios ABI, Noviembre 2007

2. Tiempos Pasados • Costosa preparación de la muestra para conseguir extractos muy limpios • Evitar contaminación cromatográfica • Mantener el sistema inerte • Maximizar sensibilidad y obtener la máxima selectividad • Pobre selectividad/sensibilidad en HPLC (tecnología de columnas, detector UV detector, Derivatizar y detector de Fluorescencia) • Difícil confirmación (mala selectividad en HPLC) • Se han llevado a cabo diferentes estrategias para conseguir mejoras

3. Smash the vegetable sample (50g) +60ml EtOAc + 13g Na2SO4 Homogeneize (20sec) Filter +60ml EtOAc + 13g Na2SO4 Homogeneize (20sec) Evaporate SPE/GPC Evaporate Reconstitute with 5ml Cyclohexane 10 fold concentration Tiempos pasados

4. Tiempos pasados • Distintas técnicas para distintos compuestos (UV, derivatización para Fluorescencia, etc.) • Pobre selectividad (longitud de onda, espectro UV) • Baja sensibilidad • Limitado número de compuestos • Duración de los cromatogramas DAD, 2mg/Kg standard

5. Ionic LC/MS Ionspray Polarity Analyte GC/MS Non-Ionic 1 2 3 4 5 10 10 10 10 10 10 Molecular Weight GC-LC/MS Polaridad/Peso Molecular

6. Evolución de LC/MS • Necesidad de confirmación por MS • Número de analitos en aumento • Gran esfuerzo en interfases (sensibilidad, robustez) • Avances en in tecnología de columnas (resolución, tiempo de análisis), sistemas de HPLC (inyección, volumen muerto, presión, etc.) • La ionización en LC/MS solo da 1 ion MS/MS • Elección entre tecnologías (Trap, Triple Quad, etc.) • Número de analitos en aumento • Identificación de desconocidos • Número de analitos en aumento

7. Ionización por Electrospray

8. Ion Spray (ESI)

9. Ion Spray (ESI)

10. Ion Spray (ESI)

11. Ion Spray (ESI)

12. Fuentes de ionización para ESI • Electrospray • hasta 1 ml/min • Dependiente de la Concentración • Ionspray (Electrospray asistido neumáticamente) • Flujos de líquido 5-200 ul/min • Mejor sensibilidad que electrospray en este intervalo de flujos • Dependiente de la Concentración • TurboIonSpray (Ionspray con gas de secado caliente) • Flujos de líquido 5-1000 ul/min • Mejor sensibilidad que ionspray en este intervalo de flujos • Dependiente de la Concentración • Fuente Turbo V (TurboIonspray con doble calefactor y dinámica de los gases) • Flujos de líquido 5-2000 ul/min • Mejor sensibilidad que turboionspray en este intervalo de flujos • Comportamiento dependiente de la masa en algunos intervalos de flujos

13. Off axis Pepperpot Crossflow LCZ aQa Estrategias para mejorar la robustez Problema:Baja tolerancia o intolerancia a sustancias poco volátiles Solución: Hacer que los iones describan un camino má o menos tortuoso (Balance entre sensibilidad y robustez) Orthogonal

14. N2 N2 Estrategias para mejorar la robustez OSA Angle TurboIonSpray® Turbo V source®

15. ESI: Mecanismo supresión iónica Supresión Iónica  Reducción señal Analito • Pares iónicos • Evite reactivos que puedan formar pares iónicos fuertes con los iones deseados y puedan neutralizar los iones en disolución. (Se reduce la evaporación de los iones) • Efectos competitivos durante la evaporación de los iones • Alta concentración de iones de carga similar en la matriz, tampones, etc. compiten en el proceso de evaporación iónica en las microgotas.

16. Supresión señal iónica Menos señal a mayor concentración del tampón

17. Comparación matrices Vegetales full scan Lechuga Naranja Uva

18. Columna 5 cm Columna 15 cm Lechuga 0.010mg/Kg Uva 0.010 mg/Kg Efecto Matriz

19. MS/MS Q1 Q2 Q3 Fuente Ioniz. SIS CID FULL SCAN Fuente Ioniz.

20. X X X X X X X X X X X X X X X 30 segundos ¿Qué “Dwell time” debo utilizar?1 transición MRM (1 compuesto) Como media, se requieren 15 puntos (o al menos 10) para integrar con precisión un pico cromatográfico (Anchura del pico)/(número de puntos)= 30/15 = 2 segundos Se necesita 1 punto cada 2 segundos (2000 ms)

21. X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X 30 segundos ¿Qué “Dwell time” debo utilizar?2 transiciones MRM (1 compuesto Cuant y Cual) Si “dwell time” permanece constante; el tiempo para cada compuesto es 2000 ms: 2000 ms + 2000 ms ----------- 2 compuestos: 4000 ms 30 segundos / 4000 ms = 7.5 puntos sólo!

22. ¿Cómo determinar el máximo número de MRMs que se pueden monitorizar simultáneamente? Anchura de pico 30 s • “Dwell time” constante => El número de puntos para definir el pico cae rápidamente Time MRM Puntos 2000 1 15 2000 2 7 2000 3 5 • Número de puntos por pico constante => “Dwell time” debe disnimuir! Dwell time (ms) MRM Puntos 3DTrap QqQ 2000 1 15 Sí Sí 1000 2 15 Sí Sí 667 3 15 Sí Sí 200 10 15 Sí/No Sí 100 20 15 No Sí 10 200 15 No Sí En una columna de 2mm id, 3mm la anchura de pico es normalmente 10 s, así que se debe dividir todo por 3

23. ¿Cómo determinar el máximo número de MRMs que se pueden monitorizar simultáneamente? Anchura de pico 10 s Para 10 puntos por pico cromatográfico => “Dwell time” debe disminuir! Dwell time (ms) MRM Data points 3DTrap QqQ 1000 1 10 Sí Sí 500 2 10 Sí Sí 333 3 10 Sí Sí 100 10 10 Sí/No Sï 50 20 10 No Sí 10 100 10 No Sí 5 200 10 No Sí A medida que disminuye el d.i. o el tamaño de partícula de la columna, la anchura de pico también disminuye, pero para mantener el número de puntos, debe disminuir el “Dwell time”

24. Prueba Columnas LC/MS. Analitos Total analytes, 43

25. Columnas Probadas • Atlantis T-3 (Waters), 100 mm, 2.1 mm, 3mm • Hypersil Gold (Thermo), 100 mm, 2.1 mm, 3mm • Hypersil Gold aQ (Thermo), 100 mm, 2.1 mm, 3mm • QS Strategy 3RP (Interchim), 100 mm, 2.0 mm, 3mm • Polaris C18 A (Varian), 100 mm, 2.0 mm, 3mm • Ascentis RP-Amide (Supelco), 100 mm, 2.1 mm, 3mm • Ascentis Express C18 (Supelco), 100 mm, 2.1 mm, 2.7mm • Sinergy Hydro (Phenomenex), 100 mm, 2.0 mm, 2.5mm Cada columna tiene su codigo individual en los datos siguientes

26. LC/MS Columns Linearity Test Número de compuestos con r2>0.99 6 diferentes concentraciones desde 0.001 a 0.200 mg/Kg, 3 replicas por concentración (18 inyecciones).

27. Prueba de anchura de pico LC/MS • Anchura de pico (anchura a mitad de altura) en segundos • Leyenda: • Muy Ancho • Ancho • Bueno Estrecho (muy bueno) • Todos los cromatogramas tienen la misma achura (2 min)

28. Prueba de anchura de pico en columnas LC/MS

29. LC/MS Columns Peak Width Test

30. Methamidophos 0.100 mg/Kg 1 2 3 4 5 6 7 8

31. Acephate 0.100 mg/Kg 1 2 3 4 5 6 7 8

32. Omethoate 0.100 mg/Kg 1 2 3 4 5 6 7 8

33. Oxamyl 0.100 mg/Kg 1 2 3 4 5 6 7 8

34. +Hexaflumuron 0.100 mg/Kg 1 2 3 4 5 6 7 8

35. Tecnologías MS Trap 3D Sensibilidad Full Scan MS3 (o más) Q TRAP QqQ Sensibilidad MRM Pérdida de Neutros Barrido de Precursores Sensibilidad Full Scan MS3 Sensibilidad MRM Pérdida de Neutros Barrido de Precursores

36. Barrido de MRM Exclusión Dinámica Umbral de señal Scans dependientes Adquisición Dependiente de la Información (IDA) Búsqueda de desconocidos • Barrido en “Multiple Reaction Monitoring” de cientos de compuestos (solamente 1 transición por analito...) • Criterio IDA (umbral...) • Adquisición automática de espectros en modo “Enhanced Product Ion Scans” en la trampa • Sustracción de Fondo Dinámica y Exclusión Dinámica • Búsqueda en bibliotecas de espectros

37. Metalaxil en uva Library CE=20V CE=20V Fit 0.956 RFit 0.956 Purity 0.955 Library CE=35V CE=35V Fit 0.953 RFit 0.955 Purity 0.951 Library CE=50V CE=50V Fit 0.735 RFit 0.618 Purity 0.607 Metalaxyl 0.009 mg/kg (0.010 mg/kg LMR en alimento infantil)

38. Conclusiones A través de los últimos años, se han desarrollado nuevas tecnologías en LC/MS (Interfases ESI, columnas, Triple Quadrupolo, MS/MS, sistemas más rápidos, Híbridos, etc.) permitiendo: • Una disminución increíble en los límites de detección • Aumento en el número de compuestos en un único análisis • Gran Selectividad • Preparación de la muestra más sencilla • Inequívoca confirmación espectral, full scan MS/MS o • Robustez del método que hace más fácil el trabajo en rutina de un laboratorio de plaguicidas. Y la historia continua...