350 likes | 492 Views
B SEJT DIFFERENCIÁCIÓ A CSONTVELŐBEN. V. D. J. TC GA CGTT AT AT. AG CT GCAA TA TA. Junctional Diversity. TTTTT TTTTT TTTTT. Germline-encoded nucleotides. Palindromic (P) nucleotides - not in the germline. Non-template (N) encoded nucleotides - not in the germline.
E N D
V D J TCGACGTTATAT AGCTGCAATATA Junctional Diversity TTTTT TTTTT TTTTT Germline-encoded nucleotides Palindromic (P) nucleotides - not in the germline Non-template (N) encoded nucleotides - not in the germline Creates an essentially random sequence between the V region, D region and J region in heavy chains and the V region and J region in light chains
How does somatic gene rearrangement (recombination) work? • How is an infinite diversity of specificity generated from finite amounts of DNA? • Combinatorial diversity • 2. How do V region find J regions and why don’t they join to C regions?12-23 rule • How does the DNA break and rejoin? • Imprecisely, with the random removal and addition of nucleotidesto generate sequence diversity • Junctional diversity(P- and N- nucleotides, see above)
Gene rearrangement and the synthesis of cell-surface IgM in B cells SUMMARY
Hogyan fejeznek ki az érett B-sejtek sejt felszíni IgM és IgD receptorokat is? Coexpression of IgD and IgM is regulated by RNA processing.
Minden B-sejt azonos specificitású immonglobulint termel A nehéz és a könnyű lánc is 2 példányban van a csíravonalban (anyai és apai kromoszómán) Mégis csak egy B-sejt receptor (BCR) képződik The B-sejt monospecifikus antitestet termel Ez alapvető fontosságú a specifikus ellenanyag válasz szempontjából. A mechanizmus ami ezt biztosítja: Allélkizárás…Allelic exclusion • Hogyan működik • Sikeres génátrendeződés gátolja a rekombinációt a másik kromoszómán • ALLÉL KIZÁRÁS • Csak egyféle H- és L-lánc szintetizálódik • A sejtfelszínre 2 H- és 2 L-láncból álló dimerek kerülnek ki • ?
Y a B a/a Y b B b/b Y a B Y Y Y b a B B b a/b ÜGYES GENETIKAI BIZONYÍTÉK AZ ALLÉL KIZÁRÁSRA ALLOTÍPUS- a H-lánc C-régió polimorfizmusa (marker) Az Ig allotípusok a B-sejtek felszínén fluoreszcens festékkel kimutathatók ÉS H-lánc átrendeződés gátlása megakadályozza, hogy egy B-limfocitában kétféle specificitás alakuljon ki
AZ ALLÉL KIZÁRÁS SZÜKSÉGES A HATÉKONY KLONÁLIS SZELEKCIÓHOZ S. typhi S. typhi Antibody Minden utódsejtnek ugyanazzal a specificitással kell rendelkeznie, máskülönben az immunválasz hatásfoka romlik A H-lánc átrendeződés gátlása az osztódó utódsejtekben megakadályozza az új specifitások létrejöttét
Az allél kizárás megakadályozza a nem kívánatos specifitású ellenanyagok képződését Y Y Y Y Y B Saját antigen pl. májsejt B Y Y Y Y S. aureus S. aureus Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Anti S. aureus Ab Anti S. aureus Ab Anti- májsejt Ab Y Y Y Y Y Y Y Y Egyféle Ag receptor/sejt HAegy sejtben kétféle Ag receptor lenne A H-lánc átrendeződés gátlása biztosítja, hogy egy sejtben csak egyféle ellenanyag képződjön Ezáltal megakadályozza a nem kívánatos auto-reaktív választ
Az allél kizárás szükséges a repertoire teljességének kialakulásához („lyuk” a készletben) Sejtenként egy Ag specificitás IFha sejtenként két specificitás lenne Y Y Y S. aureus Y B B Y B B B B Y OR Y Y B B Deléció Anergia Anti-agyi fehérje Ig Anti-agyi fehérje Ig AND anti-S. Aureus Ig Anti-agyi fehérje B-sejt kizárása – sajáttal szembeni tolerancia Anti-S.Aureus B sejtek kizáróknak és hiányoznak a készletből BUT
A CSONTVELŐBEN ZAJLÓ SZOMATIKUS GÉNÁTRENDEZŐDÉS EREDMÉNYE • Az Ig génszegmensek szomatikus átrendeződése ellenőrzött sorrendben, meghatározott program szerint megy végbe • Egy egyed különböző B-limfocitáiban a gén szegmensek kombinációja nagy számú, egymástól eltérő nehéz és könnyű lánc variábilis régiót eredményez • Egy adott egyed teljes B-sejt készlete eltérő módon átrendezett, eltérő variábilis régióval rendelkező B-limfocitából áll • A B-SEJT KÉSZLET SOKFÉLE ANTIGÉN FELISMERÉSÉRE KÉPES • 4. Egy B-sejt az allél kizárás eredményeként csak egyféle nehéz és egyféle könnyű láncot szintetizál • ELKÖTELEZETTÉ VÁLIK EGY ADOTT ANTIGÉN KÖTŐ HELY KIALAKÍTÁSÁÉRT AZ ANTIGÉN JELENLÉTÉTŐL FÜGGETLEN FOLYAMATOK A B-SEJT ÉRÉS SORÁN A CSONTVELŐBEN MENNEK VÉGBE
Az allél kizárás lehetőséget ad a limfómák diagnózisára Egyetlen egyedi átrendeződéssel rendelkező sejt klonális osztódása alapján a vérben keringő vagy csontvelői tumor sejtek aránya meghatározható Felhasználható a kezelést követő reziduális tumor sejtek követésére
Diagnosis and monitoring of the treatment of childhood acute lymphocytic leukemia (C-ALL) The sequence of the framework regions are well conserved. Step 1: design primers that amplify these regions together with the hypervariable regions Step 2: sequence the PCR fragments to obtain spec. Sequence info on the actual tumor (monoclonal, majority of amplification product is tumor-derived Step 3: based on the sequence info, design tumor-specific PCR primers Step 4: quantitate gene expression by Q-PCR. Follow success of therapy and detect minimal residual disease much earlier then by flow cytometry
A gyermekkori akut limfoblasztos leukémia (ALL) heterogén betegség Eltérő prognózisú alcsoportok Személyre szabott kemoterápia kiválasztása Minimális reziduális betegség (MRD) Terápiára adott válasz Relapszus korai felismerése Csontvelőátültetés
Minimális reziduális betegség (MRD) - nyomonkövetésére használt módszerek • Áramlási citometria: • a leukémiás sejtek abberáns protein expresszióját detektálja • kvantitatív módszer, de mintaigényes • Real-time kvantitatív PCR • a PCR specifikussága és érzékenysége + abszolút kvantitálás • minimális mennyiségű minta szükséges
MRD analízis real-time kvantitatív PCR-ral:Munkafázisok gDNSizolálás D1 és follow-upcsontvelőmintákból Multiplex PCR: IgH, TCRg, TCRd, TCRb, IgK (BIOMED2 primer-párok) Szekvenálás: Páciens-specifikusszekvencia Primertervezés, real-time kvantitatív PCR assay (QPCR) optimalizálásaéskarakterizálása 6. Follow-up csontvelőmintákanalízise, MRD kvantitálása (D8, D15, D33,M2,M3,M5,M7,M10,M12, évenként)
Result of IMGT junction analysis (http//imgt.cines.fr): IGH rearrangement of patient Q015 II. Szekvencia meghatározása ABI Prism - 3100 Avant Genetic Analyzer, ABI Big Dye Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit
V N1 D N2 J BIOMED2 Concerted Action: IgH, TCRg, TCRd, TCRb, IgK Általunk tervezett, páciens-specifikus forward primer Konszenzus próba és reverz primer IG/TCR génátrendeződések monitorozása real-time kvantitatív PCR-rel
Őssejt - HSC Korai pro-B sejt Késői pro-B sejt Nagy pre-B sejt Pre-receptor Perifériás Kis pre-B sejt Éretlen B sejt érett B sejt A B sejt fejlődés szakaszai Csíravonal DH to JH VH to DHJH VHDHJH CD19, CD10,RAG Y Receptor H+L Az egyes érési fázisokat sejtfelszíni markerek megjelenése (vagy eltűnése) jellemzi
B-cell development is dependent on bone marrow stromal cells
A CSONTVELŐI SZTRÓMA SEJTEK TÁPLÁLJÁK/SEGÍTIK A FEJLŐDŐ B- LIMFOCITÁKAT 1. Specifikus sejt-sejt kölcsönhatás a sztróma sejtek és a B-sejtek között 2. A sztróma sejtek citokineket termelnek Termelt faktorok – CITOKINEK Kolónia stimuláló faktorok Növekedési faktorok Differenciációs faktorok Sejt-sejtkölcsönhatás Sztróma sejt B A citokinek és a közvetlen sejt-sejt kölcsönhatások a differenciáció során változnak
c-Kit Receptor Tyrosine kináz CLP VLA-4 (Integrin) Stem cell factor (SCF) Sejthez kötött növekedési faktor VCAM-1 (Ig superfamily) Sejt adhéziós molekulák Sztróma sejt A fejlődés egyes szakaszaiban a citokinek és sejtkölcsönhatások változnak EBF, E2A Pax5 Korai pro-B
Interleukin-7 receptor Interleukin-7 Növekedési faktor Korai pro-B Sztrómasejt VLA-4 (Integrin) VCAM-1 (Ig superfamily) A fejlődés egyes szakaszaiban a citokinek és sejtkölcsönhatások változnak Késői pro-B Pre-B CD19, CD10,RAG és proliferáció DJ… VDJ átrendeződés
H-lánc VHDHJH V-preB l5 CHm Iga & Igbjelátvivő molekulák Pre- B sejt receptor Átmenetileg jelenik meg a membránban produktív VHDHJH CHmátrendeződés után VpreB/l5 – pót L-lánc, a membrán kifejeződéshez szükséges A pre-B sejt receptor liganduma nem ismert
The pre B-cell receptor monitors the quality of heavy chain rearrangement Mutation in λ5– arrest at Pro-B cell stage SÚLYOS IMMUNDEFICIENCIA Productive µ-lánc átrendeződés ---pre-BCR RAG gének lekapcsolása µ-lánc átrendeződés leáll ALLELIC EXCLUSION Egyféle µ-lánc és specificitás
Nagy Pre-B Ismeretlen ligand Sztróma sejt A pre-B sejt receptor stimulálásának következményei 1. Gátolja a további H-lánc átrendeződést 2. Kiváltja a belépést a sejtciklusba 1. Biztosítja az egyedi specificitást 2. A keretben leolvasható átrendeződést hordozó pre-B sejtek osztódását eredményezi ALLÉL KIZÁRÁS
Proliferáció Large pre-B Y Éretlen B sejt IgM Kis pre-B Large pre-B Large Pre-B Large Pre-B Osztódás leáll Pre-B receptor eltűnik L-lánc kifejeződés IgM a membránban Large Pre-B Large Pre-B Intracellular VDJCH chain VL-JLátrendeződés Large Pre-B Large Pre-B Large Pre-B Large Pre-B Large Pre-B Large Pre-B A pre-B sejt receptor stimulálása sejtosztódást vált ki Sok nagy pre-B sejtazonos pre-B receptorokkal
A GÉNÁTRENDEZŐDÉS LEHETŐSÉGEI V-D-J 1.allél • mRNS • Fehérje receptor V-J 1.allél mRNS fehérje V-D-J 2.allél V-J 2.allél Átrendeződés gátlása Átrendeződés gátlása V-J 1.allél mRNS fehérje V-J 2.allél Átrendeződés gátlása Nem sikeres Sikeres
Nem-produktív L-lánc átrendeződés megoldható további átrendetődéssel
A multi-specificitással rendelkező éretlen B-sejtek a csontvelőben rekednek
A monovalens saját antigéneket felismerő éretlen B sejtek anergiás állapotba kerülnek Rövid élettartam a periférián
A SZOMATIKUS GÉN ÁTRENDEZŐDÉS ÉS ALLÉL KIZÁRÁS EREDMÉNYE • Az immunoglobulin gén szegmensek szigorúan ellenőrzött átrendeződése • Egy adott B-sejt elkötelezetté válik egy egyedi H- és L-lánc variábilis domén szintézisére, ami meghatározza a specificitást • Egy adott egyedben nagy B-sejt készlet (repertoire) alakul ki, ahol az egyes B-sejt klónok különböző H- és L-lánc variábilis doménekkel rendelkeznek • Ez a potenciális B-sejt készlet sokféle különböző antigén felismerésére képes • A naív éretlen B-sejtek azonos H- és L-lánc variábilis régiókkal rendelkező IgM és IgD felszíni immunoglobulint is kifejeznek