Raidos biologijos pasiekimai medicinoje

1. Raidos biologijos pasiekimai medicinoje Simona Laurinavičiūtė

2. Raidos biologijos pasiekimai medicinoje: • Antikūnų inžinerija • Somatinių ląstelių genų terapija • Generatyvinių ląstelių genų terapija • Kamieninių ląstelių terapija • Regeneracinė medicina

3. Antikūnų inžinerija • Pastaraisiais metais sukurti nauji vaistai, padedantys efektyviau gydyti kai kuriuos piktybinius navikus (tarp jų ir kolorektalinį vėžį) – tai monokloninių antikūnų grupei priklausantys preparatai. • Tyrimai parodė, kad antikūnai veiksmingai inaktyvuoja kraujagyslių epidermio augimo faktoriaus receptorius KEAFr (angl. VEGFr) ir taip stabdo navikų augimą ir dalijimąsi. • Tačiau toks būdas nėra sėkmingas gydant krūties vėžį – manoma, todėl, kad krūties vėžys nėra taip priklausomas nuo KEAF sukeliamos angiogenezės kaip kolorektalinis vėžys.

4. Antikūnų inžinerija • 2mm auglys→ KEAF→ angiogenezė • Antikūniniai angiogenezės inhibitoriai → HIF1ά → KEAF→ angiogenezė • Dviejų žingsnių antiangiogenezė

5. Antikūnų inžinerija • Išorinis lipidinis dangalas suteikia tokį kapsulės dydį, kuris leidžia kapsulei prasiskverbti išskirtinai tik pro auglio kraujagyslių sieneles; • Apvalkalo angiogenezės inhibitoriai slopina kraujotaką į auglį ir tuo pačiu auglio viduje sulaiko citotoksinę kapsulės šerdį.

6. Genų terapija • Dabartiniai ligų gydymo metodai dažniausiai pagrįsti palengvinti simptonus, t.y. ligą lemiančių genų veiklos padarinius. • Genų terapija pagrįstų ligų gydymo metodų tikslas yra gydytii ligos priežastį, manipuliuojant ligą sukeliantį geną. • Dauguma iki šiol sukurtų genų terapijos metodų pagrįsti genetinių ligų gydymu, įterpiant transgeną (laukinio tipo/normalų geną), viliantis, kad jo raiška normalizuos ląstelės (audinio) funkciją. • Tokia procedūra praktiškai gali būti taikoma tiek somatinėms, autosominėms ir embriono ląstelėms, tačiau dėl teisinių ir etinių apribojimų, šiuo metu kuriami genų terapijos metodai yra skirti taikyti somatinėms ląstelėms. • Genų terapija kritikuojama dėl to, kad taro gydymo ir manipuliavimo žmogaus fizinėmis ir protinėmis galimybėmis yra labai plona riba. .

7. Genų terapija Veikimo principas: • Transgenas (arba nedidelė interferentinė RNR) dažniausiai integruojamas į virusinį ar lipidinį vektorių, kurio dėka genas pernešamas į šeimininko ląstelės vidų, o ten, branduolyje, vyksta trumpalaikė įterpto geno raiška. • Susidaro nedidelė transformuotų ląstelių populiacija (>1%). Į ląstelių genomą įterpta DNR dalijimosi metu perduodama antrinėms ląstelėms.

8. Retrovirusinis vektorius: virusinė DNR susintetinama atvirkštinės transkriptazės metu iš RNR. • Adenovirusinis vektorius: genome jau turi dvigrandę DNR; įterpto geno raiška gali vykti be įsiterpimo į šeimininko genomą. • Lipidinis vektorius: žiedinė DNR įterpiama dirbtinai; pūslelė susilieja su citoplazmine membrana.

9. Somatinių ląstelių genų terapija Vektoriai su įterptu genu į kamienines ląsteles gali būti integruojami dviem būdais: - ex vivo; - in vivo.

10. Somatinių ląstelių genų terapija Tyrimai parodė, kad somatinių ląstelių genų terapija buvo sėkminga gydant: • hepatitu B užkrėstų žiurkių kepenis, panaudojant nedidelę interferentinę RNR, įterptą į plazmides; • graužikų amiotrofinės lateralinės sklerozės formą, panaudojant lentivirusą ir KEAF geną į įvairius graužikų raumenis; • žmonių imonodeficitą, panaudojant laukinio tipo adenozindeaminazės (ADA) geną retrovirusiniame vektoriuje, kuris buvo integruojamas į pacientų T ląsteles; • Taip pat hemofiliją ir genetines kepenų ligas.

11. Generatyvinių ląstelių genų terapija • Šios terapijos tikslas – panaikinti nepageidaujamus genus iš individo genomo. • Terapijos tikslas gali būti siekiamas dviem būdais: • Generatyvinė ląstelė ar apvaisinta kiaušialąstė modifikuojama taip, kad naujasis genomas paveldimas kiekvienoje būsimo individo ląstelėje, taip pat ir ateities kartose. • Modifikuojamos embrioninės kamieninės ląstelės. Iš jų išsivystę individai turės didžiają dalį genetiškai modifikuotų ląstelių.

12. Generatyvinių ląstelių genų terapija • Transgeninė beždžionė ANDI (“inserted DNA” atvirkščiai) gimė kiekvienoje ląstelėje turėdama žaliai fluorescuojančio baltymo geną (angl. GFP). • GFP genas buvo įterptas į virusinį vektorių, kuris suleidžiamas tarp oocito ir pelucida zonos. Taip virusas įsiterpia į kiaušialąstės DNR, ko pasekoje GFP atsiranda visose individo ląstelėse.

13. Generatyvinių ląstelių genų terapija Generatyvinių ląstelių genų terapija prieštaringai vertinama dėl socialinių ir etinių metodo taikymo klausimų. Abejones metodo taikymu kelia ir mokslininkai. Manoma, kad: • Naujų genų įterpimas gali išstumti prieš tai funkcionavusius genus; • Virusų DNR gali įsiterpti į šeimininko DNR sekoje, koduojančioje genus.

14. Kamieninių ląstelių terapija Pagrindinės kamieninių ląstelių tyrimo kryptys: • Terapeutinis klonavimas; • Genų terapija; • Alternatyva audinių ir organų persodinimui; • Regeneracinė medicina.

15. Kamieninių ląstelių terapija Kamieninės ląstelės – ląstelės turinčios didelį potencialą atsinaujinti ir diferencijuotis į daugelį specializuotų ląstelių tipų. Išskiriami du pagrindiniai kamieninių ląstelių tipai: • Gemalo (embrioninės); • Somatinės (suaugusio organizmo). Kamieninėms ląstelėms gauti taikomas terapeutinis klonavimas / somatinių ląstelių branduolių transplantacija.

16. Terapeutinis klonavimas

17. Embrioninės kamieninės ląstelės: • Pagal diferenciacijos potencialą vadinamos pluripotentinėmis kamieninėmis ląstelėmis, t.y. gali virsti į daugumą organizmo ląstelių tipų; • Ankstyvoje embriono stadijoje formuojasi į daugiau nei 200 skirtingų tipų ląsteles; • Probleminis klinikinis taikymas dėl teisinių apribojimų ir visuomenės etinių nuostatų; • Šiuo metu žinomi du embrioninių kamieninių ląstelių išgavimo būdai: • Blastocistų vidinės masės ląstelės; • Embrionų germinatyvinės ląstelės.

18. Embrioninės kamieninės ląstelės • Blastocistai, iš kurių galima gauti embrionines kamienines ląsteles, lieka po apvaisinimo in vitro; • Germinatyvines ląsteles galima izoliuoti ir iš staigiai pašalintų embrionų.

19. Embrioninės kamieninės ląstelės Šio tipo ląstelių pritaikymo reikšmė medicinoje didžiulė: • Degeneracinės nervų ligos; • Stuburo smegenų pažeidimai; • Kasos funkcinį nepakankamumą → naujos kasos sukūrimas; • Anemija → papildymas naujomis kraujo ląstelėmis; • Širdies audinio atnaujinimas; • Imuninės sistemos stiprinimas etc.

20. Pluripotentinių ląstelių gavimo būdai • Iš morulės; • Iš blastocistų vidinės masės ląstelių; • Iš embriono generatyvinių ląstelių; • Iš somatinių kamieninių ląstelių; • Terapeutinis klonavimas (somatinės ląstelės branduolys + bebranduolis oocitas) → iš blastocistų vidinės masės ląstelių.

21. 5. Terapeutinis klonavimas pluripotentinėms ląstelėms gauti • Fibroblastų augimo faktoriai (angl. Fgf2); mezodermos ląstelės; • Fgf2; Sonic hedgehog; • Fgf2; Fgf8; SHH; • Smegenų neurotrofinis faktorius (angl.BDNF); vitaminas C;

22. Embrioninės kamieninės ląstelės Reikšmingas skirtumas tarp bandymų su žmonių ir žiurkių ląstelėmis yra tas, kad žiurkės gali būti genetiškai vienodos. Tuo tarpu žmonių embrionų kamieninės ląstelės ne tik skiriasi, bet ir išskiria didelius audinių nesuderinamumo baltymų kiekius, kurie sukelia imuninį atsaką. Siekiant išvengti atmetimo reakcijos, reikia užtikrinti kamieninių ląstelių ir paciento genetinį identiškumą: • Embrioninių kamieninių ląstelių modifikacija; • Somatinių ląstelių branduolių transplantacija / terapeutinis klonavimas.

23. SOMATINĖS kamieninės ląstelės: • Svarbios audinių, kurių ląstelės turi trumpą gyvavimo trukmę, atsinaujinimui (pvz., kraujo, epidermio) ir pasenusių, pažeistų ląstelių pakeitimui naujomis daugelyje audinių; • Labai retai dalijasi tiek audinyje, tiek in vitro. Dalijimąsi stimuliuoja telomerazės atvirkštinė transkriptazė. • Pagal diferenciacinį potencialą gali būti: - multipotentinės; - pluripotentinės.

24. Multipotentinės kamieninės ląstelės: • Riboto diferenciacinio potencialo – gali virsti į pagrindinius audinį ar organą, kuriame jos aptinkamos, sudarančių ląstelių tipus. Pavyzdžiui: CNS kamieninės ląstelės → neuronai, oligodendrocitai, astrocitai. Širdies kamieninės ląstelės → kardiomiocitai, endotelis, lygusis raumuo.

25. Multipotentinės kamieninės ląstelės

26. Multipotentinės kamieninės ląstelės: • Organuose aptinkamos santykiu 1:1000; • Sunkiai izoliuojamos iš audinių; • Ne taip lengvai panaudojamos kaip embrionų pluripotentinės kamieninės ląstelės; • Labai retai dalijasi.

27. Pluripotentinės kamieninės ląstelės: • Pranašesnės už multipotentines didesniu diferenciaciniu potencialu; • Manoma, gali būti išgaunamos iš multipotentinių kamieninių ląstelių; • Žinomi trys somatinių pluripotentinių kamieninių ląstelių šaltiniai: - Kaulų čiulpai; - Virkštelė; - Embriono donorystė motinai.

28. 1. Kaulų čiulpų kilmės kamieninės ląstelės Kaulų čiulpuose yra dviejų tipų pluripotencinės kamieninės ląstelės: • Hematopoetinės (kraujodaros). Paplitusios santykiu 1:15 000. Tai vienos greičiausiai besidalijančių kamieninių ląstelių. Naudojamos kaulų čiulpų transplantacijai, aplastinei mažakraujystei, leukemijai, hemoglobino defektams gydyti. • Mezenchiminės. Geba virsti ne tik mezenchiminio audinio (kaulo, kremzlės, riebalinio ar raumeninio) ląstelėmis, bet įterptos į organizmą gali nukeliauti į bet kurį audinį ir diferencijuotis į jam būdingas ląsteles. O tai atveria naujas mezenchiminių kamieninių ląstelių panaudojimo klinikoje galimybes.

29. Kaulų čiulpų pluripotentinės kamieninės ląstelės

30. 2. Virkštelės kamieninės ląstelės • Tyrimai rodo, kad tokios ląstelės geba virsti kremzlės, kepenų, kaulų, astrocitų, neuronų, limfocitų, širdies ląstelėmis. • Iš virkštelės kraujo izoliuotos hematopoetinės kamieninės ląstelės gali būti panaudojamos ligoniui, giminystės ryšiais nesusijusiam su donoru.

31. 3. Embriono donorystė motinai • Tyrimai parodė, kad embriono ląstelės patenka į motinos kraujotaką (lengviau yra aptikti ląstelių migraciją iš vyriškos lyties embrionų); • Kas antra sūnaus susilaukusi sveika moteris savo organizme turi vyriškos lyties embriono kamieninių ląstelių, kurios aptinkamos praėjus net ir keliems dešimtmečiams; • Manoma, tai būdas padėti motinos organizmui nėštumo metu įveikti ligos ar traumų pažeistus audinius.

32. Kamieninių ląstelių terapija Problema: Persodintos kamieninės ląstelės yra linkusios transformuotis į vėžines ląsteles.

33. Transgeninės kamieninės ląstelės • Tam tikrų organų ar audinių genetinėms ligoms gydyti gali būti taikomas kombinacinis genų terapijos ir somatinių ląstelių branduolių pernašos metodas. • Tai buvo pritaikyta pelėms, stokojančioms Rag2 geno, atsakingo už antikūnų gamybą.

34. Transgeninės kamieninės ląstelės • Somatinių ląstelių branduolio pernaša → embrioninės kamieninės ląstelės; • Mutantinis Rag2 → laukinio tipo genas; • Modifikuotos embrioninės kamieninės ląstelės → hematopoetinės kamieninės ląstelės

35. Regeneracinė medicina Mokslininkai tikisi surasti būdą kaip aktyvuoti žmonių organogenezės vystymosi mechanizmą, išsiaiškindami šiuos dalykus: • Surasti somatines kamienines ląsteles, kurios vis dar santykinai nediferencijuotos ir gali virsti reikiamo tipo ląstelėmis specifinėje aplinkoje; • Surasti tokią aplinką, kuri skatintų ląstelių ir organų genezę.

36. Kaulinio audinio regeneracija Gyjant suaugusių individų kaulų lūžiams, dažniausiai kaulinės ląstelės neatauga ir “neužtaiso” susidariusio plyšio, jei jis yra gana platus.

37. Kaulinio audinio regeneracija • Kolageno geliu impregnuotos plazmidės, pernešančios prieskydinės liaukos hormono paratiroidino geną, talpinamos tarpe tarp lūžusio kaulo galų. Šis metodas galėtų padėti pacientams, turintiems plačius kaulų lūžius ar sergantiems osteoporoze.

38. Kaulinio audinio regeneracija 2. Parakrininiais faktoriais paveiktos raumenų kamieninės ląstelės sekretuoja kaulų morfogenezės baltymą (angl. BMP4)arba kraujagyslių epidermio augimo faktorių KEAF, kurie gydo žaizdas ir gamina naują kaulą. 3. Audinio inžinerija. Dirbtiniai įtvarai, pagaminti iš medžiagos panašios į ekstraląstelinę matricą, gali būti modeliuojami į reikiamą formą. Toks įtvaras kartu su mezenchiminėmis kamieninėmis ląstelėmis, įstatomas į kaulą. Mezenchiminės ląstelės virsta osteocitais ir chondrocitais, iš kurių susiformuoja naujo kaulo dalis. 4. Fiziologinio tirpalo injekcijos tarp kaulo ir antkaulio skatina natūralią antkaulio ląstelių diferenciaciją į kremzlės, kaulo ir ligamentų ląsteles. Šis santykinai neskausmingas metodas gali būti taikomas susidėvėjusių stuburo slankstelių operacijoms.

39. Nervinio audinio regeneracija • Regeneracinėmis savybėmis pasižymi periferinės nervų sistemos motoriniai neuronai: nutrūkę aksonai geba ataugti. • Tam labai svarbus mielino dangalas. Jame esančios Švano ląstelės dalijasi ir suformuoja savotišką ląstelinį taką, nurodantį nutrūkusiam aksonui augimo kryptį, kad būtų atkurta nutrūkusi jungtis. Tuo pačiu regeneruojantis aksonas išskiria mitogenus, skatinančius Švano ląstelių dalijimąsi.

40. Nervinio audinio regeneracija CNS neuronų aksonai regeneruotis nesugeba, todėl stuburo smegenų pažeidimai gali būti ilgalaikio paralyžiaus priežastimis. Būdai, išvengti tokių pasekmių: • Padidinti nervų kamieninių ląstelių populiacijas;

41. Nervinio audinio regeneracija 2.Sukurti aksonų regeneraciją skatinančią aplinką. • CNS ląstelės – oligodendrocitai – išskiria medžiagas inhibuojančias aksonų regeneraciją:glikoproteinus ir Nogo-1. Nogo-1 receptorių blokavimas antikūnais leidžia dalinę pažeistų stuburo smegenų aksonų regeneraciją. • Aksonų regeneraciją taip pat inhibuoja po CNS sužeidimų atsiradusiuose randuose esantys chondroitino sulfato proteoglikanai. • Iš periferinės nervų sistemos transplantuotos Švano ląstelės skatina CNS aksonų augimą.

42. Nervinio audinio regeneracija CNS aksonų regeneracijos tyrimai gali tapti vienu svarbiausiu raidos biologijos įnašų medicinai.

43. AČIŪ UŽ DĖMESĮ!