1 / 42

PRO-APOPTOTSKI I ANTI-APOPTOTSKI ČIMBENICI U RANOM RAZVOJU ZUBA U ČOVJEKA

PRO-APOPTOTSKI I ANTI-APOPTOTSKI ČIMBENICI U RANOM RAZVOJU ZUBA U ČOVJEKA. Pristupnica: Danijela Kalibović Govorko, dr.med.dent. Mentorica: prof.dr.sc. Mirna Saraga-Babić, dr.med.

joyceta-bravo
Download Presentation

PRO-APOPTOTSKI I ANTI-APOPTOTSKI ČIMBENICI U RANOM RAZVOJU ZUBA U ČOVJEKA

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. PRO-APOPTOTSKI I ANTI-APOPTOTSKI ČIMBENICI U RANOM RAZVOJU ZUBA U ČOVJEKA Pristupnica: Danijela Kalibović Govorko, dr.med.dent. Mentorica: prof.dr.sc. Mirna Saraga-Babić, dr.med. Zavod za anatomiju, histologiju i embriologiju, Sveučilište u Splitu, Medicinski fakultet, Studij dentalne medicine Split, 25. ožujka, 2011.g.

  2. SADRŽAJ PREZENTACIJE • uvod • problematika i cilj istraživanja • materijali i metode • rezultati • zaključci

  3. UVOD PREUZETO IZ: ThesleffI, Nieminen P.Tooth morphogenesis and cell differentiation. Curr Opin Cell Biol, 1996. 8(6): p. 844-50.

  4. Hertwig-ova korjenska ovojnica Ektoderm prvog ždrijelnog luka Oblik korijena Vratna petlja Caklinski organ Vanjski caklinski epitel Zubna osnova Caklinska mrežica Primarni epitelni pričvrstak Reducirani zubni epitel Intermedijarni (središnji) sloj Ameloblasti Caklina Unutrašnji caklinski epitel Caklinski čvorić Uzorak krune Odontoblasti Dentin Zubna papila Nediferencirane mezenhimne stanice Fibroblasti Pulpa Ektomezenhimneuralnog grebena Cement Zubni vrećica (folikul) Cementoblasti Parodontni ligament Fibroblasti Osteoblasti Alveolarna kost

  5. CAKLINSKI ČVORIĆ • Nakupina stanica u sredini unutarnjeg caklinskog epitela • Proizvodi niz signalnih molekula (FGF, BMP, Shh, Wnt) koje utječu na rast epitela i ektomezenhima, oblikovanje zuba, prostorni raspored, broj i oblik kvržica • Primarni caklinski čvorić nastaje na vršku zubnog pupoljka, a odstranjuje se apoptozom • Sekundarni caklinski čvorići nastaju na vrhovima budućih kvržica molara te reguliraju njihov položaj i oblik

  6. Caklinski čvorić PREUZETO IZ: Koyama, E., et al., Polarizing activity, Sonic hedgehog, and tooth development in embryonic and postnatal mouse. Dev Dyn, 1996. 206(1): p. 59-72. Vaahtokari, A., et al., The enamel knot as a signaling center in the developing mouse tooth. Mech Dev, 1996. 54(1): p. 39-43.

  7. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA • Nedostatak istraživanja o ranim stadijima razvoja zuba u čovjeka • Istraživanja na pokusnim životinjama pokazala su značajne razlike u prostorno-vremenskom izražaju proliferacijskih, pro-apoptotskih i anti-apoptotskih čimbenika tijekom razvoja zuba

  8. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA • Poremećaji proliferacije, apoptoze i diferencijacije tijekom razvoja zuba i čeljusti dovode do pojave raznih patoloških promjena (često u sklopu sindroma): • Anomalije oblika, broja, veličine, građe, vremena nicanja i položaja zuba u čeljusti • Razvojnih cista i tumora

  9. CILJEVI ISTRAŽIVANJA Ki-67 Bcl-2 Kaspaza-3 Sindekan-1 Bax Hsp70 p53

  10. CILJEVI ISTRAŽIVANJA • Istražiti pojavu, raspodjelu i promjenu proliferacijske aktivnosti stanica primjenom Ki-67 biljega tijekom različitih stadija ranog razvoja zuba • Istražiti prisustvo, prostorni i vremenski slijed pojavljivanja pro-apoptotskih čimbenika kaspaze-3 i p53 u različitim dijelovima zuba tijekom razvoja

  11. CILJEVI ISTRAŽIVANJA • Utvrditi prostorni i vremenski slijed pojavljivanja anti-apoptotske bjelančevine Bcl-2, sindekana-1 i Hsp70 kao mogućih poticatelja proliferacije i diferencijacije • Dvostrukim bojenjem dokazati moguću istovremenu prisutnost različitih čimbenika u istoj stanici: • Bax i Bcl-2 • Ki-67 i Bcl-2 • Ki-67 i sindekan-1 • sindekana-1 i Hsp70

  12. METODE ISTRAŽIVANJA • Sakupljanje tkiva i određivanje starosti zametaka • Tkivo normalnih ljudski zametaka starosti 5-12 tjedana (iz postojeće arhivske zbirke Zavoda za anatomiju, histologiju i embriologiju te tkivo sakupljeno u Kliničkom zavodu za patologiju, sudsku medicinu i citologiju KBC Split, a uz suglasnost Etičkog povjerenstva za biomedicinska istraživanja MF u Splitu) • Kriteriji očuvanosti tkiva: bez vanjskih znakova maceracije, promjene boje i anomalija • Određivanje starosti: na temelju podataka o ovulacijskoj dobi, mjerenjem (CRL) te uspoređivanjem sa stadijima Carnegie instituta

  13. METODE ISTRAŽIVANJA • Vođenje, uklapanje i rezanje tkiva: • Mikrosekcija (odvajanje tkiva koje sadrži zubne zametke) • Fiksacija u 4% formaldehidu, ispiranje u PBS-u, dehidracija, ksilol, uklapanje u parafinu • Rezanje na sagitalne, frontalne ili transverzalne rezove debljine 5-7 µm • Lijepljenje na predmetna stakla, orijentacijsko bojenje svakog desetog stakla H&E (razina reza, očuvanost tkiva)

  14. METODE ISTRAŽIVANJA • Imunohistokemijsko bojenje rezova • Primarna protutijela: • Ki-67 • Bax • Bcl-2 • p53 • kaspaza-3 • sindekan-1 • Hsp70 • Sekundarna detekcija primarnih protutijela: • Bojanje DAB-om • Imunofluorescencija (TRITC i FITC)

  15. METODE ISTRAŽIVANJA • Kvantifikacija Ki-67 pozitivnih stanica i statistički postupci: • Brojenje pozitivnih stanica (smeđe obojenje stanice DAB-om) i računanje njihovog udjela u ukupnom broju stanica • Određivanje moguće statistički značajne razlike u postotku pozitivnih stanica: • Među razvojnim tjednima • Među različitim dijelovima zuba • Mann-Whitney test: neparametrijski test za dva nezavisna uzorka (dolaze li dva nezavisna uzorka iz iste distribucije) • Kruskal-Wallis i Dunnov posthoc test: neparametrijski, proširenje MW testa za tri i više grupa • Razina značajnosti je 0.05

  16. METODE ISTRAŽIVANJA • Semi-kvantifikacija: • određivanja intenziteta obojenja i prostorne raspodjele stanica pozitivnih na: • jezgrine biljege p53 i kaspazu-3 (zanemariv broj pozitivnih stanica koje se javljaju samo mjestimično) • citoplazmatske biljege Bcl-2, Bax, sindekan-1 i Hsp70 (problem razlučivanja citoplazmi pozitivnih stanica) • Kolokalizacija: • određivanje prisustva dvaju čimbenika u istoj stanici primjenom dvostruke imunofluorescencije te određivanje stanica koje pokazuju dvostruki izražaj

  17. REZULTATI • Imunohistokemijsko bojenje DAB-om • Ki-67 • Bcl-2 • kaspaza-3 • p53 • sindekan-1 • Hsp70 • Imunofluorescentno bojenje (dvostruko bojenje) • Bax i Bcl-2 • Ki-67 i Bcl-2 • Ki-67 i sindekan-1 • sindekan-1 i Hsp70

  18. REZULTATI MORFOLOŠKE OSOBITOSTI RAZVOJA LJUDSKOG ZUBA IZMEĐU 5. I 12. TJEDNA RAZVOJA 6. tj. 8. tj. 9. tj. 10. tj.

  19. 12. tj.

  20. Postotak Ki-67+ stanica u zubnom grebenu i zubnom zametku (DC) te okolnom ektomezenhimu (M) • u 6.-7. tj. DC 39%, M 37% • u 8. tj. DC 41%, M 28% • u 8.-9. tj. DC 35%, M 24% • u 10. tj. DC 14%, M 25% • od 8.-10. tj. postoji statistički značajna razlika u % Ki-67+ stanica između DC i M (Mann-Whitney, P<0.0001)

  21. Postotak Ki-67+ stanica u različitim epitelnim dijelovima zubnog zametka u 10. tjednu razvoja • IEE 37% • OEE 39% • ER 33% • DC 10% • postoji statistički značajna razlika u %Ki-67+ stanica između IEE i DC i OEE i DC (Kruskal-Wallis, Dunn-ov posthoc test, P<0.001)

  22. Postotak Ki-67+ stanica u ektomezenhimu zubnog zametka (M1) i ektomezenhimu čeljusti (M2) • u 6.-7. tj. M1 50%, M2 34% • u 10. tj. M1 28%, M2 27% • u 6.-7. tj. postoji statistički značajna razlika u % Ki-67+ stanica između M1 i M2 (Mann-Whitney, P<0.05)

  23. Postotak Ki-67+ stanica u područjima između zubnih zametaka: zubni greben (DC), ektomezenhim oko DC (M1) i ektomezenhim čeljusti (M2) • DC 35% • M1 23% • M2 15% • postoji statistički značajna razlika u %Ki-67+ stanica između DC i M1 te DC i M2 (Kruskal-Wallis, Dunn-ov posthoc test, P<0.001)

  24. 6.-7. tj. 7.-8. tj. 9.-10. tj. 11.-12. tj. Kaspaza-3 P53 Izražaj kaspaze-3 i p53 bjelančevine u zametku ljudskog zuba između 6.-12. tj.

  25. 6. tj. 8. tj. 8. tj. 10. tj. Izražaj Bcl-2 bjelančevine u zubnom zametku između 6. i 10. tj.

  26. 6.-7. tj. 7.-8. tj. 9.-10. tj. 11.-12. tj. Izražaj sindekana-1 u zametku zuba između 6. i 12. tjedna razvoja

  27. 6.-7. tj. 7.-8. tj. 9.-10. tj. 11.-12. tj. Izražaj Hsp70 u zametku ljudskog zuba između 6. i 12. tjedna razvoja

  28. Bcl-2 Ki-67 merge Bax merge Bcl-2 Dvostruko imunofluorescentno bojenje Bcl-2 i Ki-67 (7. tj.) te Bcl-2 i Bax (9. tj.) biljezima

  29. Ki-67 merge sindekan-1 Ki-67 sindekan-1 merge Dvostruko imunofluorescentno bojenje biljezima Ki-67 i sindekan-1(7. i 9. tj.)

  30. Hsp70 sindekan-1 merge 7. tj. 10. tj. 12. tj. Dvostruko imunofluorescentno bojenje biljezima Hsp70 i sindekan-1

  31. Syndecan-1/Hsp70 merge

  32. ZAKLJUČCI PROLIFERACIJSKA AKTIVNOST STANICA ZUBNOG ZAMETKA (Ki-67) • Intenzivna proliferacijska aktivnost u zubnom zametku rasla je od 6. do 8. razvojnog tjedna, a zatim značajno pala u 10. tj. razvoja. Takav uzorak proliferacijske aktivnosti stanica mogao bi biti povezan s rastom i ranim oblikovanjem osnove ljudskog zuba od stadija pupoljka, preko stadija kape do ranog stadija zvona • Od 9. tjedna nadalje, u području caklinskog čvorića nije nađena proliferacijske aktivnosti, što bi moglo ukazivati na početnu diferencijaciju specifičnih dijelova caklinskog organa u smjeru odontoblasta i ameloblasta

  33. ZAKLJUČCI • U 10. tjednu razvoja, stanice zubnog grebena imale su značajno nižu proliferacijsku aktivnost od one u ranijim razvojnim stadijima, što bi se moglo povezati s postupnim nestajanja zubnog grebena • Postotak proliferirajućih stanica bio je veći u dijelovima ektomezenhima koji se uključuje u buduću osnovu zuba od dijelova ektomezenhimu buduće čeljusti

  34. ZAKLJUČCI ANTI-APOPTOTSKA I APOPTOTSKA AKTIVNOST U STANICAMA ZUBNOG ZAMETKA Bcl-2 • Izražaj anti-apoptotske Bcl-2 bjelančevine bio je jači u stanicama koje proliferiraju tj. u Ki-67 pozitivnim stanicama, što ukazuje na ulogu Bcl-2 u poticanju proliferacije i preživljenju stanica • Izražaj Bcl-2 bjelančevine prevladavao je u dijelovima zubnog zametka (unutrašnji caklinski epitel, caklinski čvorić) od kojih će nastati specifični dijelovi zrelog zuba, potičući njihovu diferencijaciju

  35. ZAKLJUČCI • Vrlo slab izražaj Bcl-2 bjelančevine u ektomezenhimu zuba podudarao se s nižom proliferacijskom aktivnošću u istom području, što je sukladno s kasnijom diferencijacijom ektomezenhimskih od epitelnih dijelova zubne osnove

  36. ZAKLJUČCI Bax • Izražaj apoptotske Bax bjelančevine prevladavao je u stanicama zubne osnove čija je sudbina da tijekom razvoja nestanu procesom stanične smrti (vanjski caklinski epitel, caklinska pulpa) • Iste stanice zubnog zametka pokazivale su istovremenu prisutnost i pro-apoptotskog Bax i anti-apoptotskog Bcl-2 čimbenika, a razlika u njihovom prostorno-vremenskom izražaju ovisila o razvojnoj sudbini stanice • Ravnoteža navedenih razvojnih čimbenika važna je za normalno oblikovanje zuba

  37. ZAKLJUČCI Kaspaza-3 • Raspodjela kaspaza-3 pozitivnih stanica u epitelnoj osnovi zuba (u području caklinskog čvorića i caklinske pulpe) ukazuje na ulogu stanične smrti u nestanku primarnog caklinskog čvorića i caklinske pulpe kao preduvjeta normalnog oblikovanja zuba • Prisustvo kaspaza-3 pozitivnih stanica u ektomezenhimu zuba i čeljusti, govori u prilog sudjelovanju ovog razvojnog čimbenika u oblikovanju ektomezenhimskih dijelova zuba, odnosno procesu okoštavanja čeljusti

  38. ZAKLJUČCI P53 • Raspodjela p53 pozitivnih stanica u ektomezenhimu zuba ukazuje na njegovu ulogu u oblikovanju korijena, odnosno u diferencijaciji zubne vrećice u cementoblaste i fibroblaste • Prisustvo p53 pozitivnih stanice u blizini primarnog caklinskog čvorića, govori u prilog sudjelovanja ovog čimbenika u nestanku čvorića, tj. kontroli stanične proliferacije bez koje nema normalnog oblikovanju zuba

  39. ZAKLJUČCI DIFERENCIJACIJA STANICA ZUBNOG ZAMETKA Hsp70 • Jaki izražaj Hsp70 bjelančevine u epitelnoj osnovi zuba od 6.- 10. tjedna razvoja u skladu je s intenzivnom proliferacijskom aktivnošću u tom području • Jaki izražaj Hsp70 u područje caklinskog čvorića, u kojem se intenzivno sintetiziraju razne signalne molekule, ukazuje na njegovu ulogu u regulaciji stanične homeostaze i zaštiti stanice od apoptoze

  40. ZAKLJUČCI • Slabiji izražaj Hsp70 u ektomezenhimu zuba poklapao se s nižom proliferacijskom aktivnošću u istom području, što potvrđuje kasniju diferencijaciju ektomezenhimskih dijelova zuba u odnosu na njegove epitelne dijelove

  41. ZAKLJUČCI Sindekan-1 • Istovremena prisutnost izražaja sindekana-1 i proliferacijskog biljega Ki-67 u stanicama zubnog pupoljka, podudara se s njegovom ulogom u poticanju stanične proliferacije i rasta zubnog zametka • Izražaj sindekana-1 bio je najintenzivniji u području epitelno-mezenhimskih interakcija i pojačavao se s napredovanjem razvoja zuba, što govori u prilog njegovoj ulozi u staničnoj diferencijaciji

  42. HVALA NA PAŽNJI Hvala djelatnicima Zavoda za anatomiju, histologiju i embriologiju Studija medicina i dentalna medicina Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Splitu

More Related