LE CLUB DE LA TRANSPLANTATION

1. LE CLUB DE LA TRANSPLANTATION Infections virales et transplantations 6 et 7 Octobre 2005

2. RESISTANCE DU CYTOMEGALOVIRUS AUX ANTIVIRAUX APRES TRANSPLANTATION S. ALAIN, CHU Dupuytren, Limoges

3. Le Cytomégalovirus Virus de la famille des Herpesviridae Ubiquitaire Persiste sous forme latente après la primo-infection

4. La physiopathologie de l’infection favorise l’émergence de résistances

5. L’infection à CMV • Infection symptomatique après transplantation d’organe solide • Rein-pancréas : 50% • Cœur-poumon : 39-41% • Foie et pancréas : 22-29% • Cœur et rein : 8-35% • Résistance aux antiviraux après transplantation : • 0-13%

6. La résistance du CMV aux antiviraux, essentiellement au GCV, après transplantation est préoccupante à plus d’un titre : • Elle augmente la fréquence des épisodes de virémie, symptomatiques ou non, • Elle accélère le développement de la maladie à CMV, • Elle favorise le rejet de greffe • Elle augmente la mortalité. (Bhorade et al., J. Heart Lung Transpl., 2002)

7. Qu ’appelle-t-on résistance au traitement? • La persistance d ’une réplication virale sous traitement bien conduit définit la résistance clinique • Causes pharmacologiques/immunologiques/virologiques • La mise en évidence d ’une souche résistante par l ’étude du phénotype ou du génotype définit la résistance virologique

8. Comment aborder l ’étude des résistances? • Quels en sont les mécanismes moléculaires ? • Comment émerge une souche résistante ? • Quand et Comment la rechercher ? • Que représentent les résistances en transplantation d ’organe ? • Quelles conduites peut-on proposer ?

9. Mécanismes moléculaires de résistancedu CMV aux antiviraux

10. Les molécules antivirales disponibles inhibent l’ADN polymérase virale Ganciclovir GCV Cidofovir CDV Foscarnet PFA UL97 GCV-P Kinases cellulaires GCV-PP CDV-P PFA GCV-PPP CDV-PP ADN polymérase UL54

11. ACV Val-ACV GCV Val-GCV Prodrogues : Valaciclovir Aciclovir L-Valine UL97 ACV-PP ACV-PPP GCV-PP GCV-PPP ADN polymérase UL54

12. Ganciclovir Cidofovir Foscarnet Mutation Mutation UL54 UL97 Résistance au cidofovir Et Au ganciclovir Résistance au foscarnet Résistance isolée au ganciclovir Par défaut de phosphorylation Résistance croisée Association de résistances

13. 9 8 1 pp65 IE72 3 5 gB, gH 2 6 4 UL54 IE E L Cycle intracellulaire du CMV 7 UL97, UL27 pp65 EGFr Terminases

14. 9 8 1 gB, gH 7 UL97, UL27 Site d’action des antiviraux pp65 IE72 3 5 2 Maribavir EGFr Benzimidazolés Terminases 6 4 GCV, CDV, FOS UL54 IE E L

15. UL97 • Sérine-thréonine Kinase de 707 aa, 78KDa • Activée par autophosphorylation • Indispensable à la sortie des particules virales hors du noyau • Substrat naturel inconnu • Phosphoryle accessoirement le GCV • maribavir, avec UL27

16. Localisation des principales substitutions d'acides aminés responsables de la résistance au ganciclovir dans la phosphotransférase UL97 : I II III IV V VI VII VIII IX X XI NH2 COOH 460 520 594 595 601 659 603 665 606-607 397 205 590-592 594-599 • Plus de 70 % des mutations de résistance connues sont situées entre les acides aminés 460 et 607

17. UL54 • ADN Polymérase ADN dépendante, 140KDa, 3 ’->5 ’ exonucléase • Associée à une protéine accessoire UL44 • Assure la réplication du génome viral

18. Localisation des principales substitutions d ’acide aminé responsables de résistance dans UL54 Résistance au cidofovir : Résistance au ganciclovir et au cidofovir : Résistance au foscarnet Résistance au ganciclovir et au foscarnet : Exo I Exo II Exo III NH2 IV -region C II VI III I VII V COOH 301 408 495 410 412 413 419 415 501 545 503 513 516 522 588 722 756 781 787 802 805 809 812 821 D981-982 987

19. Quels sont les mécanismes d’émergence d’une souche résistante?

20. Avant traitement Après traitement Traitement Blocage du cycle viral des souches sensibles Prédominance de la souche sauvage Prédominance de la souche résistante Souche sauvage (Cycle viral normal) Souches mutantes Réplication virale => mutations+/-favorables Sélection

21. Influence des mutations sur la sélection des résistances • Les mutations de UL97 sont les premières à apparaître • Elles confèrent un niveau de résistance modéré au GCV (CI50 < 30) • Diminuent peu ou pas la capacité réplicative du virus mutant • Les mutations de UL54 apparaissent plus tardivement • Elles confèrent un niveau de résistance élevé • Mais diminuent la capacité réplicative du virus

22. Influence des mutations de UL54 sur la capacité réplicative du virus (Springer et al., J Clin Microbiol, 2005) (Ducancelle et al., J Clin Virol., 1999)

23. Emergence d ’une souche résistante in vivoEmery, J exp.Med., 1999; J. clin. Virol, 2001 Copies/ml • Cinétique virale au cours d ’une infection à CMV non traitée : • temps de doublement de la population 1 à 2 jours • Décroissance virale sous traitement : • 1/2 vie 1 à 2 jours • Emergence du mutant : • La souche mutée préexiste au traitement, devient dominante sous traitement puis redevient indétectable à l ’arrêt du traitement 200copies/ml 21j T Traitement Mutant Sauvage En compétition

24. Quels sont les facteurs de risque de résistance?Existe-t-il des facteurs prédictifs ?

25. Emergence d’ une souche résistante : Facteurs de risque après transplantation d’organe (1) • Statut sérologique D+/R- • Utilisation d’anticorps anti-lymphocytes (SAL) • Transplantation pulmonaire ou rein-pancréas • Réplication virale intense • Charge virale élevée (Nle : 4-6 log) • Augmentation rapide de la virémie • Episodes répétés de maladie à CMV • Administration prolongée d’antiviral (prophylaxie > TT anticipé) • Concentration plasmatiques suboptimales de l’antiviral au site de l’infection • Mauvaise biodisponibilité (GCV oral) • Toxicité nécessitant des réductions de dose

26. Facteurs de Risque de résistance (2) • Absence d’association entre génotype gB CMV et maladie à CMV ou résistance

27. La charge virale circulante permet-elle de prédire l’émergence de résistance après transplantation ? • Sous traitement : • Disparition de l’antigénémie en 10 à 15 jours • Négativation de la PCR en 15-21 jours • Valeur prédictive de la pente de décroissance ? Emery et al., 2001

28. La décroissance virale sous traitement lors du premier épisode d’infection à CMV est prédictive des récurrences, en l’absence de résistanceHumar et al., JID, 186, 2002

29. FDR de récurrence • Environ 60 jours après le premier épisode de maladie à CMV (ganciclovir et valaciclovir) • Absence de clearance virale à l’issue du premier traitement p<0,001 • Augmentation du délai de clearance virale 17,2js ->33,8

30. Quand craindre l’émergence d’une souche résistante? • Devant une augmentation ou une persistance de la charge virale (PCR ou antigénémie) sous traitement à dose efficace chez un patient ayant été exposé de façon prolongée à un antiviral (prophylaxie ou traitements répétés) • Ce d’autant que ce patient présente d’autres facteurs de risque de résistance • La réponse retardée au traitement ne traduit pas systématiquement une résistance, mais représente un facteur de risque de récurrence, à surveiller. • L’élévation de l’antigénémie dans les 2 premières semaines d’un traitement est possible. Elle n’est pas associée à une résistance. (Gerna et al., JID 2003; Nichols et al., Blood 2001)

31. Comment mettre en évidence une souche résistante ?

32. Méthodes de détection des résistances • Phénotype : • Définit la concentration inhibitrice 50% et 90% de l ’antiviral testé • Nécessite l ’isolement du virus en culture cellulaire • Long et difficile à standardiser • Etudie le comportement du virus quel que soit l ’antiviral ou les mutations (nouveaux antiviraux) Foyer de Cellules infectées

33. Mesure des CI50 et CI90 sur virus titré Interprétation du phénotype : CI50 du virus testé ------------------------- = IS50 > 3 CI50 souche sensible de référence

34. Concentrations de foscarnet M 0 100 200 400 Mesure en échiquierAntagonisme-indifférence-synergie Concentrations de ganciclovir en M

35. Méthodes de détection des résistances Génotype : • Recherche les mutations de résistance dans un gène donné : UL97 ou UL54 • Directement dans le prélèvement • Plus sensible que le phénotype • Permet la détection de mutations nouvelles • Non standardisé pour le CMV : • Absence de banque de données sur les mutations de résistances • Sensibilité variable des méthodes de génotypages : de 10% à 50% Amplification par PCR RFLP séquence Rapide non exhaustif Interprétation Du génotype

36. Corrélation génotype-phénotype • La mise en évidence d’une mutation connue est corrélée à la résistance clinique et phénotypique • Lorsqu’une nouvelle mutation est observée, sa responsabilité dans la résistance doit être démontrée • Par étude du phénotype des souches mutées • Par transfert de la résistance à une souche sauvage • Par étude de l’activité enzymatique de la polymérase en présence de l’antiviral

37. La présence de mélanges de souches peut être un obstacle à la détection des résistances • Les souches testées sont le plus souvent les souches circulantes. Les souches mutées peuvent être sélectionnées au site de l’infection. • Les souches mutées minoritaires peuvent ne pas être détectées, voire être perdues lors de l’isolement viral • Chez un patient multitraité peuvent coexister des souches résistantes à différents antiviraux

38. Isolat sauvage Souche mutée minoritaire Expansion de la souche résistante La détection précoce des souches résistantes est nécessaire Antiviral Souche sauvage (Cycle viral normal) Souche mutée Les techniques de séquençage doivent être standardisées et sensibles La sensibilité dépend de la méthode de séquençage

39. Patiente B. LymphomeDucancelle et al., J.Clin Virol, 2005

40. Etude épidémiologique des isolats séquentiels Isolat B3 : GCV/CDV R, PFA S 3 souches

41. N495N/K L501I/L Consensus Sense Antisense AD169

42. 501 495 Non détectée AD 169 GCC AAG ACT AAC TCG CCC AAC TAT AAG ATC AAC ACT ATG

43. Que représente la résistance aux antiviraux en pratique clinique après transplantation?

44. Les leçons du VIH : Incidence de la résistance 1 : Jabs et al, JID 1998; 2 : Boivin et al., JID 2001; 3: Jabs et al., AAC 1998; 4 : Weinberg et al., JID 2003

45. Résistance du CMV aux antiviraux après transplantation d ’organe (Lurain, JID, 2002) • 2 cohortes de patients : • Cleveland : 2345 patients suivis de 1990 à 2001 (Etude prospective) • Chicago : 200 patients présentant une infection active à CMV (Etude rétrospective) • Tous sous GCV en prophylaxie ou traitement Recherche des souches résistantes circulantes Phénotype et génotype

46. Cohorte de Chicago (Lurain, JID, 2002)

47. Cohorte de Cleveland (Lurain, JID, 2002)

48. Facteurs de risque (Lurain, JID, 2002) • Transplantation pulmonaire • Statut D+/R- (28/30 patients hébergeant une souche résistante) • Plusieurs mois ou années de traitement cumulé

49. Mutations : 19 patients -cohorte de Chicago(Lurain, JID, 2002) Résistance confirmée par le phénotype UL97 : 19/19 (100%) des patients ->codons 460 à 607 UL54 : 6/19 (30%) ->Résistance croisée au cidofovir (5/6) ->résistance associée au foscarnet (1/6, traité par foscarnet) Délai d ’apparition des mutations : UL97 : 5,5 à 36 mois UL54 : 5 à 13 mois, toujours après UL97

50. Les traitements prophylactiques sont-ils pourvoyeurs de résistance? • En faveur : • Inhibition incomplète de la réplication virale • Val ACV =ACV < GCV • GCV oral=> 45% versus 91% GCV IV • Val GCV = GCV • n ’empêchent pas la primo-infection (infection active pendant ou à l ’arrêt de la prophylaxie) • administration prolongée • En défaveur : • Faible charge virale sous traitement • Réversion de la population à l ’arrêt du traitement