Makale Sunumu

1. Lactobacillus acidophilus DSM 20079 tarafından üretilen acidocin D20079 bakteriyosininin saflaştırılması ve karakterizasyonu Makale Sunumu

2. Giriş • Gıda işleme sektöründe biyoteknoloji; mikroorganizmaların ve ürünlerinin geliştirilmesi ve seçiminin yanı sıra biyoişlenmiş ürünlerin kalitesi, süreç kontrolü ve güvenliğini de geliştirmeyi amaçlamaktadır. Geçtiğimiz on yılda, gıda katkı maddelerinin kullanımını azaltmak için genel bir tüketici talebi geliştirmiştir.

3. Giriş • Böylece birçok çalışmada, istenmeyen mikroorganizmaların inhibisyonu için gıda fermentatif bakteriler tarafından salgılanan doğal antimikrobiyal maddelere odaklanılmıştır. Kısmen benzer etkileri sağlayan terapötik antibiyotiklerin yan etkilerinden dolayı yasaklanmasının ardından bu doğal, koruyucu antimikrobiyal etkiye sahip katkı maddelerinin kullanımı artmış ve gıda güvenliği ve korunmasında önemli bir marka haline gelmiştir.

4. Giriş • Bakteriyosinler, doğal ticari gıda koruyucuların bünyesinde geniş bir alt grubu oluşturmaktadır. Bakteri tarafından üretilen ve antibiyotik özellik içeren bu maddeler, insanlar tarafından normal terapötik antibiyotik olarak algılanıp yanlış kullanım sonucu alerjik reaksiyonlara yol açmaması için bakteriyosin olarak adlandırılmıştır.

5. Giriş • Bakteriyosinler, terapötik antibiyotiklerden farklı protein maddeler olup proteazlar tarafından midede hızlıca sindirilebildiğinden şöyle anılmaktadırlar: " Bir veya birbiriyle yakından ilgili birkaç suş üzerinde bakteriyosidal aktiviteye sahip, hücre dışına salınan bakteriyel ribozomal sentezin primer veya modifiye ürünleridir."

6. Giriş • Doğal gıda katkı maddelerinin önemli bir kolu olan antimikrobiyal peptitlere karşı artan ilgi, geleneksel gıda uygulamalarında insanlar tarafından kullanılmış olan bakterilerden birçok yeni peptitlerin izolasyonu ve karakterizasyonunu içeren çalışmaların artmasına neden olmuştur.

7. Giriş • Laktik asit bakterileri (LAB) ve metabolitleri, yüksek miktarlarda herhangi bir yan etki görülmeden kültür gıdalarında kullanılmış ve sayısız insan tarafından tüketilmiştir. Bu sebeple LAB bakteriyosinleri gıda alanında kullanılan bakteriyosinlerin lokomotifi niteliğindedir. Gıda fermentasyonu ve korunmasındaki artan bu ilgi nedeniyle yeni çalışmalarda özellikle doğal mikroflora ve başlangıç kültürlerin bileşeni olarak kullanılmaktadır.

8. Giriş Birincil yapısı, moleküler kütlesi, ısı stabilitesi ve moleküler organizasyonuna göre, LAB tarafından üretilen bakteriyosinler dört sınıfa ayrılır; • Lantibiyotik-grubu olarak adlandırılan birinci sınıf, dehidre rezidüler (dehidroalanin, dehidrobütilin) içeren küçük peptitler içerirler (lantionin, beta- metil lantionin). • İkinci sınıfta, ısıya dayanıklı lantionin ihtiva etmeyen küçük peptidler bulunur. • Üçüncü sınıfı geniş ısı değişkenliğine sahip bakteriyosinler oluşturur. • Dördüncü sınıfı ise bir veya daha fazla kimyasal bileşikle birleşmiş protein parçacıklarından oluşan kompleks bakteriyosinler oluşturur.

9. Giriş • Lactobacillus acidophilusis bakteriyosin üreten LAB bakterilerinden biridir. Bu, patojenik olmayan bir Gram-pozitif bakteridir ve normal bağırsak mikroflorasının bir üyesidir. Bu, yaygın olarak fermente süt ürünlerinin üretimi için kullanılır. Probiyotik alanındaki son çalışmalar Lactobacillus acidophilusis‘in fonksiyonel ve destek gıda uygulamalarında probiyotik bir madde olarak dünya pazarında kullanımını sağlamıştır.

10. Giriş • LAB' nin L. acidophilus grubu tarafından üretilen bakteriyosinlerin çoğunluğu ısıya dayanıklı, düşük molekül ağırlığına sahip, ikinci sınıfa ait lantibiyotik içermeyen peptidlerdir. • Bu mevcut çalışmada elde edilen değerler neticesinde L. acidophilus DSM 20079 suşuna ait yeni bir bakteriyosinin izolasyonu, pürifikasyonu ve kısmi karakterizasyonuna dayalı çalışmalar yapılmış ve bakteriyosinin adının acidocin DSM 20079 olması için öneride bulunulmuştur.

11. Materyal ve Metotlar

12. Materyal ve Metotlar Tabloya ek olarak; • Lactobacillus acidophilus DSM 20079 • L. delbrueckii subsp. lactis DSM 20076 • L. delbrueckii subsp. bulgaricus DSM 20080 • Leuconostoc paramesenteroides DSM 20288 • L. sakei NCDO 2714 • Enterococcus faecium T136 • E. faecium B13 • Pediococcus acidilactici 347 • Listeria ivanovii Li4 (pVS2)

13. pH kontrolü olmadan bakteriyosin üretimi • Üretici suş, yalnızca MRS besiyerinde PEG 3350 nin farklı konsantrasyonları (5–20%, w/v) kullanılarak 37◦C de pH kontrolü olmadan 14 saat çoğaltıldı.

14. pH kontrollü bakteriyosin üretimi • 2 defa çoğaltılmış üretici suş, 2,5 litre broth medyumla biyoreaktörde inoküle edildi (%1 inokülüm). Kültivasyon sıcaklığı 37◦C ye sabitlendi ve 150 rpm de çalkalandı. pH, otomatik pH kontrol cihazı ile amonyum hidroksit çözeltisi kullanılarak titrasyon yapılıp 6’ya sabitlenmiştir. 10 ml'lik numuneler aktivite deneyleri için çıkarıldı.

15. pH kontrollü bakteriyosin üretimi • 12 saat sonra, kültür pH'ı hidroklorik asit ile 5' e ayarlandı ve bu noktada hücreler santrifüjleme ile çıkarıldı (4000 x g 10 dakika süre ile) ve bakteriyosin analizi ve saflaştırılması başlayana kadar süpernatant -20◦C'de saklandı.

16. Bakteriyosin aktivite deneyi • Kültür süpernatantındaki Lactobacillus delbrueckii alttür lactis DSM20076 suşu indikatör suş olarak bakteriyosin aktivitesi için MRS agarda tahlil edildi. Her bir indikatör tüpte 5ml MRS soft agarda (0.75%) 0.125 ml 10 kat dilue edilmiş overnight kültür bulunmaktadır.

17. Bakteriyosin aktivite deneyi • Bakteriyosin örnekleri 0,45 µm por genişliği olan selüloz asetat filtreden geçirilerek sterilize edildi. indikatör suşun büyümesi için kullanılan medyum içerisinde iki kat seri dilüsyon gerçekleştirilmiştir.

18. Bakteriyosin aktivite deneyi • Temiz bir inhibisyon bölgesi gösteren örneklerin aktivitesi, karşılıklı en yüksek seyreltme değerleri alınarak belirlenmiştir. Bakteriyosin çözeltisinin titresi AU/ml (Activity Unit/ml) cinsinde (1000/d)*D ile hesaplanmıştır. • Burada D; seyreltme faktörü, d ise; bakteriyosin çözelti miktarıdır.

19. Bakteriyosinin sıcaklık, pH ve proteolitik enzimlere karşı duyarlılığı • L.acidophilus DSM 20079 suşundan salınan ve santrifüj sonrası süpernatantta elde edilen bakteriyosinler farklı ısı,proteolitik enzim ve ph değerlerinde analiz edilmiştir. Bakteriyosin testi spot test yöntemi uygulanarak gerçekleştirildi. Spot testinden önce 70 ve 100◦C de 15, 30, 45, 60 dk ve 121◦C de 30 dk ısıtıldı.

20. Bakteriyosinin sıcaklık, pH ve proteolitik enzimlere karşı duyarlılığı • Proteazlara duyarlılığı test etmek için, 1 mllik bakteriyosin alikotlarına tripsin, ficin, pepsin, papain ve proteinaz K ile muamele edildi. Lizozim için duyarlılık 6 saat boyunca 37◦C'de 1 mg/ml 'lik bir konsantrasyonda test edildi. Hidrojen peroksit vasıtasıyla inhibitör aktivitesini tam olarak ortadan kaldırmak amacıyla hücre kültür süpernatantına 1 mg/ml katalaz ile muamele edilmiştir.

21. Bakteriyosinin sıcaklık, pH ve proteolitik enzimlere karşı duyarlılığı • İşlem görmemiş kültür ekstraktı ve yalnızca tampondaki proteaz kontrol olarak kullanılmıştır. PH etkisini test etmek için, hücre kültür süpernatantı HCl veya NaOH kullanılarak 3 ile 10 arasında değişen çeşitli pH değerlerine ayarlanmış ve 37◦C de 20 dakika boyunca inkübe edilmiştir. pH optimizasyonu uygulanmış örnekler rezidüel bakteriyosin aktivitesi ölçümünden önce pH 6 ya nötralize edilmiştir. Bu testte 3-10 arası pH değerlerinde MRS broth kontrol olarak kullanılmıştır.

22. Bakteriyosin pürifikasyonunun homojenitesi • Yukarıda tarif edildiği gibi , L. acidophilus DSM 20079 büyütüldükten sonra , hücreler santrifüj ile çıkarıldı. Süpernatant fraksiyonundaki mevcut bakteriyosin , amonyum sülfat çökeltmesi (400 g/l) ile konsantre edilmiştir.

23. Bakteriyosin pürifikasyonunun homojenitesi • Karışım 4◦C de geceboyu kaldıktan sonra oluşan çökelti 10,000g de 30 dk santrifüj sonrası pellete dönmüştür. Toplanan çökelti daha sonra 0.05M pH 5.0 sodyum asetat tamponu içinde çözülmüş ve 1kDa’luk ayırma membranı kullanılarak 4◦C de geceboyu diyaliz edilmiştir(Fraksiyon 1).

24. Bakteriyosin pürifikasyonunun homojenitesi • Fraksiyon 1, 1 ml/dk‘ lık bir akış hızında 0.05M pH 5.0 sodyum asetat tamponu ile dengelenmiş bir karboksimetil (CM) sefaroz kolonu üzerine (2 cm x 8.5 cm) uygulanmıştır. Kolon 280 nm'de hiçbir absorbans değeri görülmeyene kadar 0.073M pH 5.0 sodyum asetat tamponu ile yıkandı. Aktivite, kademeli gradyan elüsyon ile elüe edilmiştir (0.073M sodyum asetat tamponu içinde 0-0,6 M NaCI).

25. Bakteriyosin pürifikasyonunun homojenitesi • 3 mllik fraksiyonlar toplandı ve antimikrobiyal aktiviteler belirlendi. Aktif fraksiyonlar toplandı ve 20 mM pH 5.8 sodyum fosfat tamponuna karşı diyaliz edildi (Fraksiyon 2). Fraksiyon 2'ye amonyum sülfat eklenerek son konsantrasyon %10 amonyum sülfat içerecek şekilde ayarlandı ve Oktil Sefaroz CL-4B kolondan (1 cm x 6,5 cm) geçirilip 20 mM pH 5.8 sodyum fosfat tamponu içeren %10 luk amonyum sülfatla dengelenmiştir. Dengeleme tamponuyla kolon yıkandıktan sonra; aktivite, 20 mM pH 5.8 sodyum fosfat tamponu içinde % 50 etanol ile yıkandı.

26. SDS-PAGE • Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezinde (SDS-PAGE) Schagger ve von Jagow yöntemi kullanıldı. Stacking jel %4 akrilamid ve %0,5 bisakrilamid, seperating jel de %16,5 akrilamid ve %0,5 bisakrilamid içermektedir. Elektroforez stacking jelde 35mA, ayrılmada da 50mA de yürütülmüştür.

27. SDS-PAGE • 15µllik bakteriyosin örnek alikotları iki defa konsantre edilmiş 15µllik örnek buffer ile karıştırılıp 15 dk 60◦C de ısıtıldı. Moleküler kütle standartları BioRad’dan alınmıştır. Bir jel gümüş boyama ile boyandığında diğer jelde daha önce bahsettiğimiz antibakteriyel aktivite ölçüldü.

28. İzoelektrik nokta tayini • Bakteriyosin içeren süpernatantın preparatif izoelektrik odaklaması Rotofor preparatif izoelektrik odaklama cihazı (IEF) ile yapılmıştır. Phastsystem, üreticinin talimatlarına göre, bir IEF 3-9 jel kullanılarak yeniden çözünür bakteriyosin kristallerin izoelektrik nokta tayini için kullanılmıştır.

29. Kütle spektrometre analizi • Saflaştırılmış bakteriyosinin moleküler kütlesi dik bir matris destekli lazer çıkarma/iyonlaşma (MALDI) kaynağı ile donatılmış olan QSTAR® hibrid pulsari aleti kullanılarak MALDI-TOF kütle spektrometrisi (MS) ile tespit edilmiştir. Kullanılan nitrojen lazerin yoğunluğu %35 ve iyon ivme gerilimi 20kV tır.

30. Kütle spektrometre analizi • Saflaştırılmış bakteriyosin örneklerinin 5er µllik kristal süspansiyonları dikkatli bir şekilde aynı miktarda Alfa -siyano- hidroksisinamik asit ( CHC) ile karıştırılmıştır. Hazırlanan çözeltinin bir µllik kısmı perspektif 10 x 10 MALDI plaka üzerine tespit edildi ve analiz edilmeden önce 10 dakika boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakıldı.

31. Kütle spektrometre analizi • Sekans analizi için, saflaştırılmış bakteriyosin örneklerinin triptik sindiriminde Jensen ve arkadaşlarının methodu kullanıldı. Elektrosprey iyonizasyon (ESI) için bir nano-kaynak kullanıldı. Kılcal nano-sprey uygulanmadan önce, örnekler bir C18 ZipTip® kullanılarak tuzdan arındırıldı. Sindirilen örnekler %50 asetonitril içeren %0,1 lik 10µl trifluoroasetik asit ile atırıldı.

32. Kütle spektrometre analizi • Nanosprey kaynak 800V gerilim kaynağıyla pozitif iyon moduna ayarlandı. Meydana gelen peptidlerin parçalanması 12 ile 60 arasında değişen eV çarpışma enerjisi kullanılarak argon basıncı altında gerçekleştirildi. Elde edilen amino asit dizisi Mascot arama programı ve NCBI BLAST programı kullanılarak karşılaştırılmıştır.

33. Sonuçlar Bakteriyosin Üretimi: • L. acidophilus DSM 20079 suşundan bakteriyosin üretiminde ekim ilk olarak MRS medyum içeren karıştırma flasklarında yapıldı. Bu koşullarda bakteriyosin aktivitesi görülmedi. Büyüme medyumunda PEG’in farklı konsantrasyonlarının varlığı da yine üretimi etkilemedi, ve hücrelerden uzak süpernatant herhangi bir bakteriyosin aktivitesi göstermedi.

34. Bakteriyosin üretimi • Bakteriyosin üretimi genellikle pH’dan etkilendiği için üretimi kolaylaştırma adına fermentatif besiyerinde manipülasyon ve pH kontrolü yapılmıştır. Ekimler, oksijenasyonu önlemek için düşük ajitasyon altında pH kontrollü 2.5 lt otomatik karıştırmalı tank reaktör içinde büyütülmüştür.

35. Bakteriyosin üretimi • pH 5-6 arasında gerçekleştirilen bakteriyosin üretimi bakteriyosin aktivitesi açısından daha verimli sonuçlar sağlamıştır. Eksponansiyel büyüme fazında aktivite görülmedi fakat eksponansiyel fazdan durgun faza geçerken aktivite görülmektedir (Figür1).

36. Bakteriyosin üretimi

37. Bakteriyosin üretimi • Belirgin aktivite 10 saat sonra, en yüksek aktivite titreleri de 11-13 saat sonra tespit edildi. 23 saat kadar uzun inkübasyon sırasında bakteriyosin titresi çok düşük değerlere ulaştı ve sonraki aşamalarda tespit edilemeyecek kadar düştü. Aynı koşullar altında tekrar eden ekimler aynı aktivite paternlerini gösterdiğinden bakteriyosinin en yüksek titresini elde etmek, karakterizasyonunu ve saflaştırmasını sağlamak için 12 saat sonra ekimler toplandı.

38. İnhibitör aktivitenin spektrumu • Farklı bakteri suşlarına karşı acidocin D20079 inhibisyon aktivitesi spot on lawn methodu ile test edildi. L. acidophilusDSM 20079 tarafından üretilen bakteriyosin inhibitör spektrumu oldukça dar ve hassas, ayrıca Lactobacillus cinsi ile sınırlıdır (Tablo1).

39. İnhibitör aktivitenin spektrumu • Inhibitör aktivite belirgin bir şeklide yalnızca L. delbrueckiisubsp. lactis DSM 20076 suşuna karşı değil aynı zamanda L. bulgaricusDSM 20080 ve L. sakeiNCDO 2714 suşlarına da karşıdır. Çalışılan diğer patojenik suşlarda herhangi bir aktivite tespit edilmemiştir. En yüksek duyarlılık göz önüne alındığında bakteriyosin aktivitesinin kantitatif tayininde L. delbrueckiisubsp. lactis DSM 20076 suşu kullanılmıştır.

40. L. acidophilus DSM 20079 suşunun ürettiği acidocin D20079’un stabilitesi • Organik asitlerin olası etkisini (pH’ın 6.5 a ayarlanması) ortadan kaldırmak için ve hidrojen peroksit varlığında (katalaz muamelesi) bir inhibisyon etkisini ortadan kaldırmak için inhibe edici ajanın aktivitesi belirlenen koşullarda test edilmiştir. Ne pH ayarlaması ne de katalaz muamelesi bakteriyosin aktivitesini etkilememiştir.

41. L. acidophilus DSM 20079 suşunun ürettiği acidocin D20079’un stabilitesi • Acidocin D20079 ‘un ısı muamelesine duyarlılığının oluşturduğu inhibitör aktivite 70°C ve 100°C de 60 dk dan sonra herhangi bir değişiklik göstermemektedir. Ayrıca, aktivite 121°C de 30 dakika sonra % 50 oranında azalmıştır. Bu sonuçlar L. Acidophilus DSM 20079 tarafından üretilen antimikrobiyal maddenin güçlü ısıya dayanıklı olduğunu göstermektedir .

42. L. acidophilus DSM 20079 suşunun ürettiği acidocin D20079’un stabilitesi • Kültür süpernatantındaki bakteriyosin aktivitesinin pH stabilitesi 3 ile 10 pH değerleri arasında incelenmiştir. Aktivite genellikle 4 ile 9 pH arası değerlerde değişmezken daha düşük ve daha yüksek değerlerde oldukça düşmektedir. Antimikrobiyal maddenin protein yapısında belirlemek için, bakteriyosin aktivitesi bazı proteolitik enzimlerin (tripsin, proteinaz K, ficin, papain ve pepsin) etkisiyle test edilmiştir.

43. L. acidophilus DSM 20079 suşunun ürettiği acidocin D20079’un stabilitesi • 37°C de 6 saat inkübe edilen örneklerde bu enzimlerin her biri tamamen antimikrobiyal aktiviteyi ortadan kaldırmıştır. Lizozim muamelesi diğer çalışmalarda test edilmiş ve bakteriyosin aktivitesi üzerine bir etkisi görülmemiştir. 4°C de 2 ay veya dondurulmuş olarak 6 ay saklamanın aktiviteyi etkilemediği tespit edilmiştir.

44. L. acidophilus DSM 20079 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin saflaştırılması • Bakteriyosin tablo 2 deki 3 aşamalı saflaştırma protokolü uygulanarak homojen hale getirildi. İlk olarak amonyum sülfat presipitasyonu uygulandı. Yaklaşık olarak 8 kat konsantre edilmiş ve %94 oranında geri kazanılmış bakteriyosin elde edildi. Saflaştırmanın ikinci aşamasında CM Sefaroz kolon ile farklı NaCl konsantrasyonları ile antimikrobiyal aktivite kontrol edildi.

45. L. acidophilus DSM 20079 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin saflaştırılması • Maksimum aktivite 0,4 M NaCl konsantrasyonunda elde edildi ve aşama sonrası verim %65 civarındaydı. Son saflaştırma safhasında ise %50 lik etanol ve hidrofobik Oktil-Sefaroz kolonu kullanılarak kolon presipitasyonu sağlandı. Fakat en büyük kayıp bu aşamada gözlendi (%16 verim).

46. L. acidophilus DSM 20079 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin saflaştırılması • Aktif bakteriyosin fraksiyonları yüksek moleküler ağırlığa sahip bir vaziyette iki bant olarak elektroforezde gözlenmiştir. SDS-PAGE de bakteriyosin peptidi tespit edilemedi. Bunun sebebi 0,01 ng/ml konsantrasyondan daha yüksek konsantrasyonların kristalleşmesi veya acidocin D20079 un asidik izoelektrik noktasından dolayıdır.

47. L. acidophilus DSM 20079 suşu tarafından üretilen bakteriyosinin saflaştırılması

48. İzoelektrik nokta (pI), moleküler kütle ve kısmi sekans tespiti • Yeniden çözünen kristallerin analitik olarak izoelektrik odaklanması ile bakteriyosinin izoelektrik noktası yaklaşık olarak 3-3,5 arasında elde edilmiştir. Daha önceki çalışmalarda L. acidophilusN2 suşunun ürettiği lactatin B bakteriyosinin değerleriyle aynı olarak bu çalışmada da IEF analizi bakteriyosin aktivitesinin geniş bir pH aralığına yayıldığını göstermiştir.

49. İzoelektrik nokta (pI), moleküler kütle ve kısmi sekans tespiti • Moleküler kütle tayini için fraksiyonlar preparatif IEF’ten toplanıp tripsin-SDS-PAGE’ e tabi tutuldu. Bakteriyosinin jeldeki pozisyonu aktivite analizi ile teyit edilmiştir(Figür 2A ve 2B) ve moleküler kütle yaklaşık olarak 6kDa olarak belirlenmiştir.

50. İzoelektrik nokta (pI), moleküler kütle ve kısmi sekans tespiti Jel gümüş boyamaya tabi tutulmuştur. Soldaki ilk 4 kuyu farklı süpernatant grupları içermektedir. 5 ve 6. kuyular sırasıyla triosefosfat izomeraz 26625 kDa, miyoglobin 16950 kDa, laktalbümin14437 kDa ve aprotinin 6512 kDa standartları içermektedir. Sağ taraftaki kuyular ise IEF analizine tabi tutulmuş kısmen saflaştırılmış fraksiyonları içermektedir. Bakteriyosin bantlarını doğrulamak için jel L. delbreckii subsp. lactis DSM 20076 hücreleri ile kaplanmış ve MRS soft agarda inkübe edilmiştir. 37◦C de bir gece inkübasyon sonrası gümüş boyanmış inhibisyon bölgeleri görülmektedir.