¿Cómo presentar un artículo original de investigación?

1. ¿Cómo presentar un artículo original de investigación? Alfredo Prieto Martín Professor in Immunology at Alcalá University Coordinator of Post grade program in Immunology Consultant in the field of Problem Based Learning Administrator of: Web site on PBL http://www2.uah.es/problembasedlearning WebBlog site on PBL: http://www.e-pbl-es.tk Contact me at : alfredo.prieto@uah.es or http://www.alfredoprieto.tk Unidad mixta CSIC/UAH

2. Meta mensaje= lo que tienes que contar Un ejemplo con metodología al descubierto Cómo lo muestras Presentado por Alfredo Prieto

3. Empieza contándoles de que vas a hablar El tema de la presentación Presentado por Alfredo Prieto

4. Resumen Resume el trabajo: ¿Qué hicieron? • A pacientes con melanoma metastásico, se les extraen linfocitos T, se seleccionan los antitumorales, se expanden y se reinfunden al paciente tras la quimioterapia. • Los tumores regresan Expansión Linfocitos antitumorales Reinfusión en Individuo linfopénico Repoblación y Agresión al tumor Pacientes con melanoma Linfodeplección del paciente con quimioterapia

5. Resumen ¿Qué han encontrado? • Las células T reinfundidas proliferan in vivo y repueblan persistentemente a los pacientes, infilttran los tejidos tumorales y provocan su regresión asi como la destrucción autoimmune de melanocitos. Inmunidad antitumoral Proliferación e infiltración del tumor Reinfusión 1 $ Auto- inmunidad

6. Resumen ¿Qué significa? • Esta aproximación permite tratar a pacientes cuyo SI no es capaz de eliminar un cáncer o una infección incurable como el HIV Cáncer Inmunidad antitumoral Reprogramación inmune Inmunidad antiinfecciosa HIV Infection

7. Aporta background a tu audiencia Introducción a la Introducción: • Melanoma • Estadiaje • Terapia e inmunoterapia • Inmunoterapia adoptiva • Reordenamientos TCR y Pruebas de clonalidad • Crecimiento homeostásico • 5. Mecanismos de la inmunidad antitumoral

8. Introducción a la Introducción Melanomaconcepto • Tumor de melanocitos • Tumores altamente metastásicos, primero a ganglios después a vísceras y tejido nervioso • Causa: exposición intermitente al sol en gente con piel clara • 1 de cada 74 WASP los desarrollan en USA Imagen de Internet

9. Introducción a la Introducción Melanoma-vitíligo Imagen de Internet La Inmunidad Antitumoral Es un tipo benéfico de autoinmunidad

10. Introducción a la Introducción Tratamiento del melanoma: Quimioterapia no funciona Inmunoterapía IFNa IL-2 Terapia celular adoptiva

11. Introducción a la Introducción 2. Inmunoterapia celular adoptiva (ACT) • Se lleva intentando desde los 80 sin resultados clínicos espectaculares. • Funciona in vitro y en ratones pero hay pocos resultados clínicos en humanos. • Vida corta de las células T infundidas. • Baja tasa respuestas parciales en melanoma metastático estadio 4 (5-15%).

12. 4. Crecimiento homeostásico • Proliferación de linfocitos T maduros sin necesidad de estimulación antigénica. • Se estimula en situación de linfodepleción. • Il-7, IL-15 e IL-21 son factores de crecimiento homeostásico muy importantes.

13. Introducción a la Introducción INMUNOTERAPIAS CELULARES ADOPTIVAS: TIL, LAK • SA Rosenberg pionero e impulsor • Extracción TIL PBL, selección y expansión in vitro de células antitumorales • Se han abandonado tras décadas de esfuerzos infructuosos (Sanchez-Mateos P. SEI 2002) • Science Octubre 2002

14. Introducción Introducción I:¿por qué y qué? • ¿Por qué? • Explica las razones por las que el estudio fue realizado • ¿Qué? • Establece la cuestión respondida por el trabajo ¿Por qué hacerlo? Porque actualmente no hay ningún tratamiento eficaz contra el melanoma metastásico ¿Qué prueban? ¿Contribuirá la Quimioterapia al eliminar a los linfocitos a crear un mejor ambiente para la expansiónin vivo de células antitumorales?

15. Materiales y métodos Establece la aproximación experimental¿Qué se hace y qué se mide? • Linfodepleción del paciente por quimoterapia • Activación de linfocitos antitumorales in vitro • Demostración de su capacidad antitumoral • Expansión in vitro • Expansión in vivo de los linfocitos antitumorales en el huésped • Deplecionado de células T maduras • El injerto T se expande el numero de células T efectoras antitumorales se amplifica in vivo • El efecto antitumoral es muy intenso y efectivo

16. Materiales y Métodos:Background e ilustraciones didácticas detalladas sobre cómo lo hicieron • Protocolo • Métodos de selección y expansión • Estudio de efectos terapéuticos y secundarios

17. Célula T T Cell TCE T Cell Célula T T Cell T Cell Célula T Linfodepletion followed by adoptive cell transfer (L+ACT)and IL-2 treatment 1. TIL Extraction 3.T Cell Administration (heterogeneous populations) Clinical response Cell Activation Clone expansion and demonstration of antileukemic activity +IL-2 high dose 25% mixed responses 50% Objective Responses 11.5% complete responses 2. Lymphodepletion Ciclophosphamide + Fludarabine

18. Materiales y métodos Expansion with OKT-3 allogeneic feeder + IL-2 6000 UI/ml In vivo IL-2 Reinfusión 2. Selección y expansión de linfocitos T antitumorales - - - - + - - Cytokine release assay induced by autologous tumor cells

19. Materiales y métodos 3. Estudio de efectos: caracterización de los linfocitos expandidos e infundidos • Correceptores CD4/CD8 • Actividad citotóxica • Especificidad antigénica, reactividad • Capacidad de unión a tetrámeros con ag de melanoma • Actividad lítica específica • Producción citocinas • Región variable de la cadena b (Vb)

20. Materiales y métodos Estudio de efectos terapéuticos y secundarios • Efecto terapéutico • Respuesta completa desaparición completa del tumor • Respuesta parcial (PR) Reducción >50% diámetros de todas las metastasis observables6/13 • Respuesta mixta (MR) Regresión de algunas metástasis 10/13 • Efectos secundarios (Autoinmunidad) • Vitiligo depigmentación autoinmune por destrucción de melanocitos • Uveitis inflamación de la uvea

21. Resultados (y más) • 1. Muestra el método, diseño experimental, resultado y conclusión de cada experimento • en la misma diapositiva en la que se muestran los resultados del experimento • No olvides el significado del resultado: la conclusión

22. Resultados Índice Experimentos • Demografía población pacientes • Repoblación linfoide • Clonalidad de la repoblación Vb y CDR3 • Persistencia de las células transferidas • Especificidad y función efectora de las células transferidas • Efectos clínicos: manifestaciones antitumorales y autoinmunes • Hallazgos anatomo-patológicos infiltración anti tumoral de repertorio restringido

23. Resultados 2. Repoblación linfoide: Método: linfodepleción, reinfusión, recuentos seriados de cifras linfocitos y neutrófilos Resultados Evolución temporal de las cifras de linfocitos (ALC,) y neutrofilos (ANC, Ο) cifras resurgen y se mantienen altas. Conclusión Los linfocitos reinfundidos repueblan al paciente, linfocitosis y extravasación

24. 3. estudios de clonalidad(background) • TCR es responsable de la Reactividad inmune de los linfocitos T. • Región variable beta (Vb) expresada por los linfocitos T ab • Cada linfocito expresa una de 23 posibles • En un repertorio policlonal cada Vb es expresado por un pequeño porcentaje de linfocitos T • Un repertorio oligoclonal indica que algunos clones están muy crecidos determinados Vb estan muy elevados

25. Resultados 3. Estudios de clonalidad • Objetivo: • Uso de genes Vb del TCRen linfocitos CD8 + infiltrantes de tumor (TIL) y linfocitos de sangre periférica tras el tratamiento. • Método: • Para investigar el destino de las células T transferidas se examinó la región variable del TCR usando anticuerpos específicos frente a regiones variables de su cadena beta (Vb) para medir el % de linfocitos T que expresan cada una de las 23 regiones Vb

26. Resultados 3. Estudios de clonalidad Resultado Vbexpression was highly skewed (under-lined and bold) in 5 of the 6 administered TIL, and some of these same Vbfamilies were also over represented in the PB of the patients at one week after cell transfer, Conclusión: Los clones derivados de los TIL injertan persistentemente. Linfocitos de sangre repoblados provienen de los clones predominantes en los TIL y persisten.

27. Resultados Fenotipo blástico de los PBL de pacientes reinfundidos Método Blood smears from pat 9 (left) and pat 10 (right) during the lymphocytic episodes Resultado they showed the highly activated phenotype of the lymphocytes, which contain irregular and hyperchromatic nuclei, high nuclear to cytoplasmic ratio and toxic granulation. Conclusión los linfocitos infundidos mantienen su proliferación in vivo

28. a1,2,3 b2m Mecanismos de la inmunidad antitumoral (background) HLA-A2 • Los linfocitos TCD8 reconocen antígenos en moléculas de histocompatibilidad de clase I presentados por células de melanoma y las matan. • El tejido tumoral se inflama y atrae más leucocitos: APCs y linfocitos T. • El alelo más frecuente de la molécula HLA-A es el A2 • HLA-A2 presenta eficientemente antígenos de melanoma bien caracterizados. • Tetrámeros HLA-2 pueden cargarse con péptidos antigénicos de melanoma Gp100 MART-1 Ag.

29. Resultados 4. Persistence of the MART-1 reactive clones Método marcaje con antiVB y tetrameros HLA-A2/MART-1 Diseño PBLs from patients 9 (left) or 10 (right) were analyzed by FACS using antibodies against specific TCR Vbfamilies (Vb7, ; Vb12, ; Vb14, ; average of other Vb ) or HLA-A2/MART-1:26-35(27L) tetrameric complexes (A2/MART tetramer, ). Resultado Las células VB12 son antiMART. Las células antimelanoma dominan en los PBL tras 4 meses. Conclusión La repoblación con células antimelanoma es persistente por más de 4 meses

30. 5. Mecanismos de la inmunidad antitumoral • Linfocitos T CD4 al reconocer antígenos tumorales producen IFN. • El IFN induce sobrexpresión de moléculas de histocompatibilidad de clase I y II en las células tumorales. • Esto es un suicidio para las células tumorales si el tumor esta infiltrado por linfocitos T antitumorales.

31. Resultados 5. Función de células Ttransferidas: Secreción de interferón g Método PBL collected 9 days (pat 9, left, pat 10, right) after cell transfer were cultured overnight in the absence (striped boxes) or presence (solid boxes) of 600 IU/ml IL-2, washed, and tested for cytokine release Diseño Se usan distintas APCs para estimiular la secrección Resultado Responden a antígenos de melanoma presentados en HLA-A2. Conclusión secretan IFNg en respuesta a melanoma, IL-2 aumenta secreción

32. 5. Actividad Citotóxica Resultados Método: lisis de de células de melanoma marcadas radioactivamente TIL PBL after PBL before Resultados The infused TIL () and PBL collected 7 days after cell transfer (), but not pretreatment PBL () from patients 9 (left) and 10 (right) specifically lysed the HLA-A2 + melanoma cell line 526 (lower graphs) but not the HLA-A2 - 938 (upper graphs). ConclusiónLa infusión con TIL genera actividad CTLMHCI restricta por HLAA2.

33. Resultados 6. Manifestaciones Antitumorales de la transferencia de linfocitos T anti-MART-1 Método Tomografía computerizada Conclusión los linfocitos transferidos pueden eliminar metástasis

34. Resultados 6. Efectos secundarios: vitíligo manifestaciones autoinmunes: As cancer regressed in the lower extremity of patient 9, patchy areas of vitiligo appeared as shown on the forearm. Conclusiónlos linfocitos transferidos agreden no solo a células de melanoma también a melanocitos cutáneos normales

35. Resultados Efecto del tratamiento en los nódulos tumorales: Metodo inmunohistoquímica en nodulos tumorales Conclusión La infusión induce: 1) Infiltration by CD8+ T cells,2) Expression of MHC I y II by tumor cells sporadic staining (macrophages) but minimal of tumor cells strong stromal cell staining but weak of tumor cells scant CD8 + cells diffuse CD8 + infiltrate ubiquitous expression in tumor cells

36. Resultados 7. Inmunopatología en nódulos tumorales: repertorio de linfocitos infiltrantes Metodo inmunohistoquímica en nodulos tumorales Resultados A resected tumor nodule (p9 day 20) shyows infiltrating CD8 + Vb12 +, but no Vb7 + T lymphocytes. Similarly, a residual tumor nodule biopsied (p10, day 14) contained areas densely infiltrated by CD8 + Vb7 + T cells but few Vb12 +. Conclusión Los linfocitos infiltrantes en los nodulos tumorales expresan los mismos VB de los TIL originales

37. Discusión • Sipnosis de resultadoslista compuesta de las conclusiones principales de los experimentos más relevantes. • Integración de resultados • Aplicaciones e implicaciones • Repercusiones y recomendaciones

38. Discusión 1. Sipnosis de los resultadosy conclusiones • Células tumorales pueden usarse para activar TIL que pueden expandirse in vitro • La reinfusión en el paciente linfodeplecionado provoca repoblación persistente por células eficaces en la eliminación de células tumorales • Las células antitumorales son capaces de detener el crecimiento del tumor localmente en un 75% de los pacientes tratados y en casi un 50% de los pacientes son capaces de detener su crecimiento en todo el organismo y destruir mas de un 50% de la masa tumoral

39. 2. Integra los resultados de los experimentos en un mensaje más global Discusión • Los autores demuestran que la terapia con linfocitos antitumorales en huéspedes linfodepleccionados es la mejor terapia para el melanoma metastático

40. 3. Discute las aplicaciones e implicaciones Discusión • Esta aproximación puede ser igualmente exitosa en otros contextos • Inmunoterapia de otros tumores • Inmunoterapia de infección por HIV y HCV

41. 4. Repercusiones Discusión La repoblación linfoide con células antileucémicas expandidas in vitro en pacientes linfodeplecionados tiene un enorme potencial como terapia antitumoral Los investigadores en el campo no debemos dejar escapar una oportunidad así

42. Créditos • Búsqueda bibliográfica y recursos on line Eduardo Reyes • Animaciones y transiciones David Díaz • Guión y coordinación Alfredo Prieto

43. Bibliografía y webgrafía • Manuales y diccionarios que has utilizado • Direcciones de los sitios web de los que has obtenido información Facilitar a tu audiencia el acceso a las fuentes de información que has utilizado

44. Cuestiones

45. Hemos visto • Como ordenar la presentación de un artículo • La introducción a la introducción es muy importante • Hay que aportar imágenes para ilustrar la introducción y los materiales y métodos. • Como contar un experimento recapitulando su background e integrando si es posible en una diapositiva: método, diseño experimental resultado y conclusión.

46. No olvidéis • Presentación del articulo • Definir la cuestión a la que responde el artículo • Aportar background para comprender el contexto de esta cuestión y por que es importante • Cuando sea útil mostrar los modelos y diseños experimentales • Presentar los datos de las figuras describir como se realizan los ensayos y las conclusiones que se alcanzan.

47. Ejercicios Evaluación de vuestro artículo • Evaluar el artículo que presentéis: • Comentar los aspectos fuertes y débiles que encontráis en el abordaje y el diseño experimental • Juzgar si están bien soportadas y justificadas las conclusiones • Describir asuntos pendientes o cuestiones o nuevas áreas que el artículo abre para estudios futuros.