Iñaki Albizu Rafael Baselga

1. ELABORACION DE AUTOVACUNAS FRENTE A DISENTERIA Iñaki Albizu Rafael Baselga

2. SEMANAS VACUNADOS NO VACUNADOS 1 - 3 3 - 6 6 - 8 8 - 9 9 -10 10 - 11 11 - 12 150 371 141 117 59 134 111 115 375 165 111 41 138 91 EXPERIENCIA FRENTE A DISENTERIA PORCINA Hampson y cols en Australia (Aust. Vet. J. 70,1,18) demostraron la efectividad de las vacunas frente a la Disentería producida por Brachyspira hyodysenteriae. Análogamente Diego y cols en España (Vaccine, 13,7 663) también concluyeron su efectividad en animales de cebo a través del crecimiento (tabla 1), la sintomatología clínica y la excrección de Brachyspiras. Phillips y cols también la han demostrado utilizando como antígeno una proteína aislada de Brachyspira hyodysenteriae. Del mismo modo Hampson y cols (Vet Microbiol. 2000 Apr 4;73(1):75-84), también han demostrado la efectividad de las vacunas frente a Brachyspira pilosicoli. En nuestra experiencia, el uso de autovacunas es muy efectivo (http://www.disenteria.info/opinion.html), y además económicamente resulta muy ventajoso, tal y como se puede comparar en http://www.disenteria.info/coste.html, porque la autovacuna sólo se aplica en madres, con una dosis de recuerdo en cada parto. Tabla. 1 Ganancia de peso, en gramos, en cerdos vacunados y no vacunados en el periodo de cebo (Adaptado de Diego y cols. Vaccine, 13,7 663)

3. PROTOCOLOS DE APLICACIÓN DE LAS AUTOVACUNAS Los protocolos de aplicación dependen de la fase en que aparezca la Disentería. Si la DISENTERIA aparece en MADRES: Vacunar 3 veces en sábana a todas las cerdas con tres semanas de intervalo entre cada dosis. Vacunar de recuerdo cada 4 meses o 15 días antes de cada parto. Incorporar este plan vacunal a la reposición. Administrar tratamiento antibiótico en agua o pienso hasta dos semanas después de la administración de la 3º dosis. Después, normalmente, se puede retirar el antibiótico. Los animales mas afectados deberán recibir además tratamiento inyectado. Si la DISENTERIA aparece en POSTDESTETE: Aplicar el protocolo anterior en madres. Vacunar y revacunar lechones 15 y 30 días antes de la aparición de los síntomas. Dejar de vacunar lechones cuando estos procedan de madres que han recibido las 3 dosis. Si la DISENTERIA aparece en CEBO: Aplicar el mismo protocolo anterior en madres. Vacunar y revacunar lechones en el destete y 30 días después. Dejar de vacunar lechones cuando estos procedan de madres que han recibido las 3 dosis. Los animales mas afectados deberán recibir tratamiento inyectado. En todos los casos en que se usan autovacunas recomendamos mejorar las medidas de control y bioseguridad.

4. TOMA DE MUESTRAS El diagnóstico Brachyspira hyodisenteriae y pilosicoli se hace por aislamiento a partir de heces, colon o ileon, o hisopos rectales. Conviene tomar heces de 4-5 animales de un mismo parque en un sólo bote y enviar muestras de 3-4 parques. El diagnóstico se puede demorar hasta 21 días por la dificultad de eliminar contaminaciones con Campylobacter u otras Espiroquetas. COMO SE HACEN LAS AUTOVACUNAS Los tiempos del protocolo indicado son aproximados porque no todas las cepas de Brachyspira hyodysenteriae y/o pilosicoli necesitan el mismo tiempos de crecimiento. Además, en muchos de los pasos no lo indicamos porque son procesos que sólo llevan unas horas y que pueden, o no, realizarse en un mismo día. Al recibir un pedido por fax, teléfono o a través de la web se pide confirmación firmada al veterinario, ya que una autovacuna necesita una receta como cualquier otro medicamento veterinario.

5. ELABORACION DE AUTOVACUNAS DIA 1 Cuando el veterinario nos solicita una autovacuna, descongelamos la cepa conservada y la sembramos en medios de crecimiento sólidos. Muchas veces las bacterias acaban de ser aisladas porque las muestras se han enviado con el propósito de elaborar una autovacuna y evitamos el tiempo empleado en descongelar las cepas. La gran mayoría de las cepas congeladas crecen en 48-72 horas y podemos visualizar las colonias en agar sangre como una beta hemólisis característica. Se comprueba que el inóculo incial que se emplea no está contaminado y es una Brachyspira. Vial de congelación. Las cepas se guardan congeladas e identificadas en viales de congelación durante al menos 5 años. El mismo día preparamos y esterilizamos un pequeño volumen de crecimiento, el cultivo iniciador, que servirá para iniciar el cultivo final y un volumen de medio de crecimiento suficiente para fabricar las dosis solicitadas, aunque la concentración final de antígeno se estandariza después de realizar el recuento final de bacterias. Estos medios de crecimiento llevan suplementos muy especializados que no se esterilizan con autoclave. Para iniciar la vacuna se utiliza el crecimiento de una cepa de Brachyspira hyodysenteriae en agar sangre y un caldo de cultivo especialmente diseñado para su crecimiento.

6. DIA 3 Se inocula una suspensión del cultivo original en sólido al cultivo iniciador. Para ello una masa de bacterias del cultivo inicial en agar sangre se siembra en el medio líquido. El medio se incubará a 37º C. durante 48 horas en anaerobiosis. La cepa de Brachyspira se recoge con un asa de siembra para inocular un volumen de 100 ml de caldo de cultivo. Para conseguir que una bacteria crezca en anaerobiosis (ausencia de oxígeno) tenemos que eliminar el oxígeno no sólo del ambiente donde multiplicamos la bacteria sino también del medio líquido en el que crecerá. Inoculación del caldo de cultivo con la cepa de Brachyspira recogida de la placa de agar sangre. Las botellas inoculadas se incuban a 42ºC durante 24-48 horas. Cultivo de Brachyspira en 100 ml de caldo de cultivo tras 24-48 de incubación a 42ºC. Obsérvese la turbidez. Detalle de la cepa de Brachyspira recogida con asa de siembra sobre agar sangre

7. DIA 5 El cultivo iniciador se utiliza para iniciar el cultivo final en el volumen total necesario. En las primeras horas después de la siembra las bacterias se multiplican de un modo exponencial cada pocas horas, justo hasta que consumen la mayoría de los nutrientes del medio. En la gráfica se ve como el número de bacterias aumenta muy rápidamente. Cuando la mayoría de los nutrientes han sido consumidos la velocidad de multiplicación es mucho menor, pero es ahora cuando en muchas especies bacterianas aumenta la producción de exopolisacáridos bacterianos. Botella con crecimiento de Brachyspiras (izda) comparada con una botella sin inocular. Se observa turbidez y cambio de color del medio, indicadores de un crecimiento masivo y abundante que se cuantificará mediante citometria de flujo. En nuestro caso es importante determinar el momento en el que se inactiva el cultivo porque tenemos que maximizar el crecimiento de la Brachyspiras y al mismo tiempo impedir que las bacterias que comienzan a degradarse contaminen el medio con ADN y proteínas intracelulares. Gráfica: Crecimiento de bacterias y producción de exopolisacáridos.

8. DIA 7 Inactivamos las bacterias añadiendo formalina al medio de crecimiento donde se han multiplicado y dejamos que el formol actúe durante otras 18-24 horas antes de comenzar con la purificación de los antígenos. Antes de inactivar el cultivo nos aseguramos de la pureza y ausencia de contaminación del cultivo. Observación en microscopía de campo oscuro del cultivo de Brachyspiras. Permite verificar la ausencia de otras bacterias y comprobar la vitalidad. DIA 8 Después de la inactivación y utilizando una alicuota hacemos el recuento total de las bacterias mediante citometría de flujo. Esto nos permite ajustar las concentraciones bacterianas de modo que en las autovacunas utilizamos cantidades análogas y reproducibles de antígeno. En el protocolo de Disentería separamos parcialmente los exopolisacáridos de los cuerpos bacterianos. Por un lado concentramos los cuerpos bacterianos mediante filtración tangencial y lavamos las células descartando proteínas, restos de ADN, restos metabólicos, etc. Por otro lado procesamos los exopolisacáridos bacterianos siguiendo los protocolos ya descritos (Vet Microbiol 1994 Apr;39(3-4):195-204). Recuento de bacterias en citómetro.

9. LIPOSOMAS Los liposomas de la autovacuna se han fabricado independientemente. Los liposomas son pequeñas vesículas de lípidos que después de la liofilización encerraran en su interior el antígeno purificado de las Brachyspiras. Los liposomas se elaboran con una mezcla de lípidos que se conserva congelada. Los liposomas son pequeñas vesículas de lípidos que incorporan en su interior (hidrosolubles) o en su membrana (liposolubles) los antígenos con los que se mezclan. Antes de la liofilización mezclamos los liposomas con una suspensión de antígeno, que liofilizamos. En la liofilización congelamos la muestra y extraemos el agua, de modo que los liposomas se rompen. Al resuspender la autovacuna, los liposomas se cierran de nuevo incorporando el antígeno en su interior. El proceso de elaboración de los liposomas se ejemplifica aquí. Las vesículas de lípido se rompen en la liofilización y al reconstituirlas con agua atrapan al antígeno. Liofilizador trabajando. En su interior se observan viales con liposomas liofilizándose.

10. ELABORACION DE AUTOVACUNAS DIA 10 Los viales se retiran del liofilizador y se confirma que están bien. Se hacen los ensayos para confirmar la ausencia de contaminación. La autovacuna se envía liofilizada, lo que facilita su conservación. El producto final se ensaya en diferentes medios para confirmar la total ausencia de contaminación.

11. Recepción Receta del pedido Preparación estéril Veterinaria (telefono, web) de liposomas Día 1 Preparación Día 2 del medio de Descongelación crecimiento de cepas en volúmenes adecuados Día 3 Multiplicación Día 4 bacteriana, inicial Día 5 Multiplicación Día 6 bacteriana final Control de Día 7 Inactivación calidad Recuento de bacterias Citometría de Flujo. Estimación de la carga antigénica. Ajuste al número de dosis. Día 8 Separación Mezcla de los Separación de los de los liposomas con los exopolisacáridos cuerpos exopolisacáridos bacterianos capsulares capsulares Liofilización Envasado Día 9 de la mezcla bacterina Producto Día 10 acabado Día 11 Fin Control . Calidad Día 15 AUTOVACUNAS FRENTE A DISENTERIA