PODSTAWOWE TECHNIKI stosowane w BIOLOGII MOLEKULARNEJ

PODSTAWOWE TECHNIKI stosowane w BIOLOGII MOLEKULARNEJ

ENZYMY RESTRYKCYJNE ENDONUKLEAZY RESTRYKCYJNE RESTRYKTAZY • Są to enzymy należące do hydrolaz. • Stanowią grupę wyodrębnioną spośród DNaz. • Charakteryzują się tym, że rozpoznają konkretne • sekwencje w obrębie dwuniciowego DNA i często • hydrolizują konkretne wiązanie.

Nagroda Nobla w dziedzinie medycyny/fizjologii 1978 “for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics” Werner Arber, Daniel Nathans, Hamilton O. Smith Szwajcar Amerykanie

Enzymy restrykcyjne • Zostały odkryte jako enzymy bakteryjne rozkładające fagi wnikające do komórek bakteryjnych. • W komórkach bakteryjnych w parze z każdą endonukleazą restrykcyjną występuje metylotransferaza rozpoznająca dokładnie tę samą sekwencję. Metylotransferaza metyluje niektóre zasady w obrębie tej sekwencji i w ten sposób zabezpiecza bakteryjny DNA przed strawieniem przez własny enzym restrykcyjny. • Taka para enzymów tworzy system R-M -system restrykcja-modyfikacja (ang. restriction-modification system).

Schemat działania systemu R – M na przykładzie restryktaz typu I Curr. Opin. Microbiol.2005, 8:466–472, Tock MR. and Dryden DRF: The biology of restriction and anti-restriction.

Enzymy restrykcyjne • Znamy ponad 3000 restryktaz o250 różnych specyficznościach. Izoschizomery to enzymy pochodzące z różnych bakterii, ale wykazujące tę samą specyficzność (np. EcoRI i FunII rozpoznają i hydrolizują w ten sam sposób sekwencję: GAATCC) • Restryktazy to enzymy bardzo różnorodne pod względem wielkości i sekwencji aminokwasowej. • Na przykład: • Enzym Pvu II - 157 aminokwasów (18 kDa) • Enzym Cje I – 1250 aminokwasów (145 kDa)

Enzymy restrykcyjne Nazwa każdego enzymu pochodzi od skrótów nazw bakterii, z których dany enzym wyizolowano + numer (rzymski).

Enzymy restrykcyjne Wyróżnia się 4 typy enzymów restrykcyjnych: I, II, III, IV Tylko enzymy typu II są stosowane w biologii molekularnej, bo tylko one hydrolizują wiązanie w obrębie rozpoznawanej sekwencji. Rozpoznają sekwencje palindromowe, 4-8 nukleotydowe. Palindrom: słowo, zdanie, wiersz, które mają to samo znaczenie czytane normalnie i wspak. Klasyczne: Kobyła ma mały bok Współczesne: A ma bok cara Barack Obama

Palindromy DNA są nietypowe – musimy uwzględnić to, że DNA jest dwuniciowy Popija rum As, samuraj i popJulian Tuwim POPIJARUMAS ---------------------- ---------------------- SAMURAJIPOP

Przykładowe sekwencje rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne 5’-GGCC-3’ 3’-CCGG-5’ 5’-TCGCGA-3’ 3’-AGCGCT-5’ 5’-GCGGCCGC-3’ 3’-CGCCGGCG-5’ Enzymy restrykcyjne typu II są zwykle homodimerami (Dlaczego?) http://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_enzyme

Odp. prawidłowa: 5’ A T T A A T 3’ 3’ T A A T T A 5’ Odp. nieprawidłowe: 5’ A T T T T A 3’ 3’ T A A A A T 5’ 5’ A T T T T A 3’ 3’ A T T T T A 5’ Pytania na egzamin: 1. Uzupełnij sekwencję DNA rozpoznawaną przez typowy enzym restrykcyjny: 5’ A T T ––– 3’ 3’ –––––– 5’

5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’ Enzymy restrykcyjne typu II mogą hydrolizować wiązanie w miejscu osi symetrii rozpoznawanej sekwencji. Powstają wówczas niekohezyjne (tępe) końce DNA 5’- AGCT-3 ’ 3’- TCGA -5’ Sma I Alu I

...lub hydrolizują wiązania poza osią symetrii rozpoznawanej sekwencji. Powstają wówczaskohezyjne (lepkie)końce DNA

Zarówno przy powstawaniu lepkich jak i tępych końców – wiązanie fosfodiestrowe jest hydrolizowane tak, że na 3’ końcu pozostaje grupa –OH a na 5’ końcu grupa fosforanowa.

Co to jest aktywność enzymatyczna? – definicja Jak można zdefiniować aktywność enzymu restrykcyjnego? Definicja musi być na tyle uniwersalna, aby naukowiec mógł porównać preparaty enzymów oferowane przez różne firmy. Np. Firma X oferuje 500U NotI za 200€ Firma Y oferuje 1000U NotI za 320€ Kupię enzym z firmy Y pod warunkiem, że obie firmy posługują się taką samą definicją U dla enzymów restrykcyjnych.

Jedna jednostka aktywności (U) enzymu restrykcyjnego to taka jego ilość, która jest potrzebna do całkowitego strawienia 1 mg DNA faga l*rozpuszczonego w 50 ml w ciągu 60 min w warunkach optymalnych dla działania enzymu (temperatura, bufor) Wszystkie enzymy typu II wymagają do swojej aktywności jonów Mg2+ Aktywność enzymów restrykcyjnych *lub inny DNA zawierający dane miejsce restrykcyjne

Ewolucja niektórych enzymów restrykcyjnych zachodziła przez horyzontalny transfer genów 4 konserwatywne elementy strukturalne

Skąd można wnioskować, że dany gen pojawił się w wyniku horyzontalnego transferu genów? Jedną z przesłanek może być wynik analizy wykorzystania kodonów, gdyż różne organizmy w różnym stopniu wykorzystują różne kodony.

Ciekawostka: Nie wszystkie enzymy restrykcyjne rozpoznają sekwencje palindromowe. Np. enzym BbvC I: rozpoznaje sekwencję CCTCAGC Jak to jest możliwe? Bo enzym nie występuje jako homo- lecz jako heterodimer.

Jak można wykorzystać enzymy restrykcyjne? • Manipulacja odcinkami DNA o znanych sekwencjach – możemy w konkretnych miejscach przecinać DNA (a potem dzięki innemu enzymowi, ligazie, łączyć dowolne uzyskane fragmenty) - klonowanie • Możemy identyfikować konkretne sekwencje w obrębie danego DNA – analiza restrykcyjna

Analiza restrykcyjna rejonu promotorowego genu ADAM17 (praca magisterska Magdy Strzeleckiej) S K H B E/B S E H B S – standard wielkości K – kontrola, fragment DNA niepoddany trawieniu H – Hind III E – Eco RI B – Bam HI Negatyw żelu agarozowego wybarwionego EtBr

Jak wykrywać określone sekwencje DNA? Southern blotting • Poddajemy genomowy DNA trawieniu restrykcyjnemu (uzyskujemy bardzo wiele różnych fragmentów). • Poddajemy DNA elektroforezie. • Denaturujemy (alkaliczna denaturacja). • Przenosimy DNA na filtr nitrocelulozowy lub PVDF* • Hybrydyzujemy z sondą wyznakowaną radioizotopowo (jeden z nukleotydów zawiera 32P). • Odpłukujemy niespecyficznie związaną sondę. • Filtr poddajemy autoradiografii. *PVDF – polifluorek winylidenu

Po denaturacji i hybrydyzacji: Southern blotting Sonda to odcinek dwuniciowego DNA o sekwencji identycznej (a więc i komplemetarnej) do fragmentu sekwencji DNA, którą chcemy wykryć. wykrywana sekwencja sonda

Technika Northern blotting Polega na hybrydyzacji znakowanej sondy z cząsteczkami RNA unieruchomionymi na membranie. Pozwala na określanie poziomu specyficznych mRNA w komórkach określonego typu w określonych warunkach (badanie transkryptomu). Technika Northern blotting będzie dokładnie omówiona na wykładzie z Genetyki molekularnej

Southern blotting - hybrydyzacja DNA-DNA (od nazwiska Edwina Southerna) Northern blotting - hybrydyzacja RNA-DNA Western blotting - wykrywanie konkretnych białek przez przeciwciała • Eastern blotting – termin się wykluwa – co się przyjmie? • Wykrywanie glikozydów unieruchomionych na membranie (np. po chromatografii) przez przeciwciała • Wykrywanie różnych potranslacyjnych modyfikacji białek przez przeciwciała (lub innymi metodami) • Wykrywanie białek przez aptamery (oligonukleotydy) znakowane radioizotopowo lub fluorescencyjnie

Sekwencjonowanie DNA • Metoda chemiczna Maxama-Gilberta (już raczej nie używana) • Metoda enzymatyczna Sangera; • (metoda z użyciem dideoksynukleotydów) Metoda Sangera: Prowadzimy reakcję syntezy DNA na matrycy DNA w czterech probówkach. Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się niewielkiej ilości dideoksynukleotydu (do każdej probówki innego). Wbudowanie ddNTPzatrzymuje reakcję polimeryzacji (brak grupy –OH przy C3’). Powstają odcinki DNA różnej długości, które analizuje się elektroforetycznie. Walter Gilbert i Frederick Sanger – 1980 – otrzymali po ¼ Nagrody Nobla z chemii (1/2 otrzymał Paul Berg za rekombinację DNA)

Dideoksynukleotyd Jeśli w trakcie syntezy do DNA zostanie wbudowany dideoksynukleotyd to synteza zatrzymuje się. Brak grupy -OH przy C-3’ uniemożliwia przyłączenie kolejnego nukleotydu.

Sekwencjonowanie DNA – metoda Sangera 5’-ATGTCAGTCCA-3’

Przykładowe sekwencjonowanie Prawy panel – typowy obraz „przeciętnego” fragmentu DNA Lewy panel – sekwencja bogata w nukleotydy G i C. Długi fragment o sekwencji złożonej z powtórzeń GGC. http://www.cambio.co.uk/l3.php?l1_category_id=3&l2_category_id=93

Warianty metody Sangera • Zamiast znakowanego deoksynukleotydu można stosować znakowany starter. • Zamiast znakowania izotopem (32P lub 35S) można znakować starter znacznikiem fluorescencyjnym. • Można również znakować fluorescencyjnie dideoksynukleotydy – każdy innym znacznikiem i reakcję polimeryzacji prowadzić w jednej probówce.

Sekwencjonowanie DNA może być zautomatyzowane - sekwenatory DNA Intensywność fluorescencji Kolejne nukleotydy w sekwencji

Po nałożeniu czterech wykresów uzyskujemy przykładowy następujący obraz:

Porównanie klasycznej metody Sangera z wariantem gdzie dideoksynukleotydy są znakowane różnymi barwnikami fluorescencyjnymi: http://www.steve.gb.com/images/science/dna_fluorescent_sequencing.png

Sekwencjonowanie genomów Ciekawostka: największy poznany genom ma Polychaos dubium (ameba) (6,7 x 1011) (dane niepotwierdzone!!!) a wśród kręgowców - prapłetwiec abisyński (1,3 x 1011).

Metoda Maxama i Gilberta • Metoda chemiczna. • Znakuje się jeden koniec DNA (32P). • Rozdziela się DNA do 4 probówek i poddaje działaniu 4 różnych związków chemicznych, które modyfikują konkretne zasady: G, A+G, C, C+T. • Ta modyfikacja (usunięcie zasady z łańcucha) umożliwia hydrolizę DNA w tym miejscu przez piperydynę. • Przeprowadza się elektroforezę. • Odczytuje się sekwencję. piperydyna

Metoda Sangera opiera się na syntezie komplementarnej nici DNA. Metoda Maxama i Gilberta opiera się na hydrolizie pojedynczej nici DNA.

Synteza DNA na stałym podłożu • Jednoniciowe cząsteczki DNA można syntetyzować przez kolejne dołączanie konkretnych nukleotydów. • Pierwszy nukleotyd zostaje unieruchomiony na stałym podłożu tak, że ma wolną grupę 5’-OH. • Nukleotyd, który ma zostać przyłączony ma zablokowane wszystkie grupy, które nie powinny brać udziału w reakcji.

DMT zasada (zablokowana) b-CE fosfoamidynian deoksynukleozydu Nukleotydy do reakcji syntezy oligonukleotydu Każdy z wyjątkiem pierwszego: DMT – grupa dimetoksytritylowa b-CE – grupa b-cyjanoetylowa Grupa 3’OH: zamiast fosforanu występuje fosfoamidynian

Pierwszy nukleozyd (koniec 3’) zasada (zablokowana) przez tę grupę hydroksylową unieruchomiony na złożu

Triester fosforanowy (III) Triester fosforanowy (V)

In vivo – synteza DNA przebiega od 5’ do 3’ końca Syntetyczne oligonukleotydy (in vitro) syntetyzowane są od 3’ do 5’ końca Jeśli mamy do syntezy oligonukleotyd: 5’-A T T G T C A T T G G C C T A G G A C G -3’ 20 18 16 14 12 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 in vitro

Synteza oligonukleotydów – podsumowanie • Pierwszy nukleotyd (właściwie nukleozyd) unieruchomiony (wolna grupa 5’-OH). • 2. Dodaje się 3’ fosfoamidynianu konkretnego (zadanego) nukleotydu i zachodzi reakcja. Tworzy się triester fosforanowy (III). • Triester fosforanowy (III) utlenia się (+I2) do triestru fosforanowego (V). • Odblokowuje się grupę 5’-OH przyłączonego nukleotydu (kwas dichlorooctowy odłącza DMT) • PRZEPŁUKUJE SIĘ ZŁOŻE (po co?) • Dodaje się kolejny 3’-fosfoamidynian nukleotydu

cd. 7. Po zakończeniu syntezy wszystkie grupy blokujące zostają usunięte (NH3) a zsyntetyzowany łańcuch DNA (do ok. 100 nukleotydów) odłączony od złoża. 8. Izoluje się najdłuższy DNA – tylko taki DNA ma kolejno przyłączone wszystkie nukleotydy.

Kary Mullis (1/2 nagrody) "for his invention of the polymerasechain reaction (PCR) method" Jeszcze jeden Nobel... The Nobel Prize in Chemistry 1993 - "for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry" Drugą część nagrody otrzymał wówczas Michael Smith (Kanadyjczyk) za badania nad ukierunkowaną mutagenezą

PCR Łańcuchowa reakcja polimerazy Łańcuchowa reakcja polimeryzacji (ang. polymerase chain reaction) • Reakcja PCR służy do powielaniałańcucha DNA. • Można uzyskać 106 –109 razy więcej określonego • DNA niż w materiale wyjściowym. • Kluczową rolę odgrywa zastosowanie • termostabilnej polimerazy DNA z Thermus • aquaticus (polimeraza Taq). ŹLE – reakcja łańcuchowej polimerazy – ŹLE

PCR - cykliczne przeprowadzanie 3 etapów procesu. Każdy z tych etapów wymaga odpowiedniej temperatury. Zmiana temperatury musi następować szybko (termocyklery). 1. Denaturacja dsDNA (95°C, 30 s) 2. Przyłączanie starterów (~54°C, 30 s) 3. Polimeryzacja (~72°C, 1 min na 1000 pz)

Stopień amplifikacji zależy od ilości cykli (n) i w optymalnych warunkach wynosi 2n. 20 cykli: 220 > 1×106; 30 cykli: 230 > 1×109;

Mieszanina reakcyjna: • DNA – matryca • Startery (18 – 30 nukleotydów) • Deoksyrybonukleotydy • Polimeraza Taq • Bufor zawierający jony Mg2+ Zwykle prowadzi się 20 - 30 cykli

PODSTAWOWE TECHNIKI stosowane w BIOLOGII MOLEKULARNEJ