Xenotrasplante de islotes porcinos y células de Sertoli en pacientes diabéticos tipo 1.

1. Xenotrasplante de islotes porcinos y células de Sertoli en pacientes diabéticos tipo 1. Dr. Rafael Valdés González-Salas Laboratorio de Xenotrasplantes, Hospital Infantil de México Federico Gómez, México, D.F. MEXICO.

2. Antecedentes

3. Antecedentes • Diabetes en México. • Evolución del tratamiento convencional. • Evolución del esquema intensivo • Trasplante de islotes (alogénico). • Trasplante de islotes (xenogénico).

4. Justificación • Aún con el esquema intensivo las complicaciones aparecerán. • En transplantes alogénicos: • Escasez de donadores cadavéricos. • Mayor riesgo de transmisión de enfermedades. • Complicaciones quirúrgicas • Daño hepático • Alto costo del tratamiento inmunosupresor • Alto riesgo de complicaciones secundarias • Tiempo de sobrevida corto

5. Xenotrasplante • Riesgo de infección por Retrovirus Endógeno Porcino (PERV) • Otras zoonosis

6. Retos del Xenotrasplante • Supervivencia de las células implantadas: • Rechazo inmunológico • Factores no inmunológicos • Compatibilidad funcional de las células implantadas • De la insulina porcina y otras hormonas • De los sistemas reguladores humanos

7. Diseño Experimental • Creación de un sitio inmunológicamente privilegiado: • Dispositivo • Formación de colágena autóloga • Inmunomodulación por células de Sertoli • Trasplante Islotes + Sertoli

8. Dispositivo Usamos un dispositivo diseñado en nuestro laboratorio, que consiste en un cilindro de malla metálica de 6 cm de largo, con dos tapones de polipropileno, uno de ellos con un émbolo que llena el cilindro.

9. Implante del dispositivo Dos meses antes del xenotrasplante, dos a cuatro dispositivos fueron implantados subcutáneamente en la pared abdominal anterior.

10. Procesamiento de Islotes y Sertolis El páncreas es removido inmediatamente después de eutanasia por exanguinación. Se utilizan cerdos de 7 días de vida Los islotes y las Sertolis son cultivados separadamente a 37°C El páncreas y los testículos son macerados y digeridos con una solución de Liberasa HI.

11. Control de calidad La viabilidad es determinada por tinción de ioduro de propidio (Islotes:94%, Sertoli 95%) La pureza de los islotes es de 88% Con tinción de Ditizona. Funcionalidad: Índices de estimulación de Islotes =11.5 Sertoli: detección de Closterinas Pureza de Sertoli 93.6%: por MIS y sox9. Apoptosis (Islotes: 4.8%, Sertoli 10.5%) Cytometría de flujo contra Annexina

12. Reclutamiento totalmente voluntario Pronóstico con tratamientos actuales Procedimiento Experimental Objetivos Metas Riesgos Costo económico Obligaciones del voluntario Obligaciones del Hospital Diseño Experimental • 12 adolescentes con Diabetes Tipo 1 • Consentimiento Informado:

13. Bioética • Instituciones revisoras: • Comisión Nacional de Bioética • Facultad de Medicina, UNAM • Hospital Infantil de México Federico Gómez

14. Bioética • Cumplimiento de la declaración de Helsinki • “Art. 32. Cuando los métodos preventivos, diagnósticos o terapéuticos disponibles han resultado ineficaces en la atención de un enfermo, el médico, con el consentimiento informado del paciente, puede permitirse usar procedimientos preventivos, diagnósticos y terapéuticos nuevos o no probados, si, a su juicio, ello da alguna esperanza de salvar la vida, restituir la salud o aliviar el sufrimiento. Siempre que sea posible, tales medidas deben ser investigadas a fin de evaluar su seguridad y eficacia. En todos los casos, esa información nueva debe ser registrada y, cuando sea oportuno, publicada. Se deben seguir todas las otras normas pertinentes de esta Declaración..”

15. Diseño Experimental • Monitoreo: • Requerimientos de insulina exógena • Hemoglobina glicosilada • Insulina porcina circulante • Antígenos Anti a-Gal y hemolíticos de cerdo • PERV (incluyendo familiares cohabitantes) • 1 dispositivo removido 3-5 años después, para permitir el retrasplante y tratar de obtener independencia de la insulina. • Detección inmunohistoquímica de: • Células positivas a Glucagon • Células positivas a Insulina • Células positivas a CD3, CD4 y CD8 • Células positivas a MIS y sox9 (Sertoli)

16. Seguridad • Medidas de seguridad de los animales en la granja: • Granja cerrada y aislada (5km). • Red contra aves. • Barreras contra roedores. • Programa extensivo de vacunación • Cuarentena estricta (Baño de entrada – Baño de salida). • Monitoreo de salud aleatorio. • Registro e identificación detallada de cada animal.

17. Seguridad • Medidad de seguridad de los animales donadores. • Tamiz microbiológico para: • Aujeszky (elisa) • Erisipela (elisa) • Salmonella sp.(elisa) • Salmonella sp.(cultivo de hígado y válvula ileocecal) • Brucella a. (aglutinación). • Influenza Porcina (inhibición de aglutinación) • Leptospira (microaglutinación 16 especies). • Mycoplasma hyopneumoniae (elisa) • Coronavirus (elisa) • Toxoplasmosis (elisa)

18. Contingencias Observ. Clínica o de Lab sospechosa Contactar familias y Personas cercanas Reunión de Personal Granja Productora Manual de bioseguridad de la granja Secretaría de Salud Instituciones Externa Diagnóstico Hospital OMS Cuarentena Tratamiento específico Tratamiento Seguimiento

19. Retrovirus Endógeno Porcino • Carriles: • Marcadores de tamaño • Control Negativo • DNA porcino • DNA de Pacientes 1 2 3 4 2036 1636 1018 506 396 PERV 814 bp

20. 2° Tx 2nd Tx Resultados • Anticuerpos Anti a-Gal 4500 4000 3500 12 3000 2500 9 títulos 8 2000 12 1500 1000 11 12 12 500 5 8 0 PreTx Día 7 Día 14 1mes 3mes 6mes Día 7 1mes 1año Tiempo Post trasplante

21. Anticuerpos en el ensayo Mexicano (2000-2001) vs. El Sueco (1990-1993) Títulos de hemaglutininas IgM contra eritrocitos porcinos replicando exactamente el método de Lindeborg E. Xenotransplantation 2001: 8; 273-283. p<0.0001, Mann-Whitney U test 256 * 128 64 32 Titer (mean ±sem) 16 8 4 2 Valdes et al. Groth et al.

22. Requerimientos de Insulina

23. Resultados • El primer grupo de 12 pacientes trasplantados al primer año del trasplante, • 6 no tuvieron reducciones, 6 mostraron reducciones variadas. Hemoglobina Glicosilada 7.4 10.8 9 13 6.6 8.9 7.1 9.9 7 12 6.7 7.9 Paciente (% Reducción)

24. Resultados • Detección de insulina porcina en suero por HPLC

25. Resultados • Un dispositivo fue removido de cada uno de los pacientes, para poder ser retrasplantados y posiblemente llegar a la independencia de insulina. • Los dispositivos removidos fueron analizados por inmunohistoquímica para insulina, glucagon, MIS (un marcador de células de Sertoli), y CD3, CD4 y CD8.

26. Insulina HE 4 4 3 3 1 1 2 2

27. Glucagon

28. Sustancia Inhibidora Mulleriana (MIS)

29. Resultados 4 5 3 CD3 Humano 1 2 6 Q-03-164-5 4 5 Insulina 3 1 2 6

30. Resultados

31. Conclusiones • No ha habido señales de zoonosis • No hay complicaciones metabólicas • No hay intolerancia al dispositivo o al procedimiento. • El sistema inmune de los pacientes se mantiene intacto, medido por reacciones intradérmicas.

32. Conclusiones • Respuesta Inmune • Persistencia de insulina (100% de los dispositivos removidos) y células positivas a glucagon (90%) en cantidades variables después de 5 años, y de manera sorprendente, coexistiendo con linfocitos T • No hay correlación entre los niveles de anticuerpo y supervivencia de las células. • No hay una respuesta típica después del retrasplante

33. Conclusiones • Modificaciones en los requerimientos de insulina exógena • En 50% de los casos hubo reducciones, en algunos casos cerca de 100% por varios meses. • El otro 50% pudiera no haber tenido suficientes células supervivientes, o una menor sensibilidad a la insulina. • La presencia de insulina porcina se ha podido detectar en la circulación por medio de HPLC

34. Pasos Inmediatos • Identificar los sistemas antigénicos en el cerdo que sean importantes para el xenotrasplante a humano • Respuesta humoral • Anticuerpos Anti a-Gal • Grupos sanguíneos tipo ABO • Fenómeno de Acomodamiento en los dispositivos • Pruebas de reactividad cruzada para antígenos proteicos en islotes y Sertolis contra anticuerpos humanos preformados. • Respuesta celular • Caracterización de los linfocitos T en los dispositivos.

35. Pasos Inmediatos • Cuantificación de la composición celular dentro de los dispositivos.

36. Hospital Infantil de México “Federico Gómez”

37. Colaboración con otras Instituciones. Dr David White, Robarts Research Institute, University of Western Ontario Dr Camillo Ricordi, Dr Luca Inverardi Diabetes Research Institute, University of Miami Dr Gordon Weir, Joslin Diabetes Center. Boston, MA Dr Robert Elliott, Diatranz Ltd, New Zealand