MATERIELS ET METHODES

1. Analyse des modifications protéiques induites par l’inhibition du canal CFTR H. AHSEIN, C. GUERRERA*, D. TONDELIER, M. BAUDOUIN-LEGROS, L. JEANSON et A. EDELMAN INSERM U 806, Université Paris V, Faculté de Médecine Necker * : Plateau protéome IRNEM INTRODUCTION La mucoviscidose (MV) est la maladie génétique létale la plus fréquente chez les sujets caucasiens. Elle est due à des mutations du gène cftr qui code pour la protéine membranaire CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator), fonctionnant comme un canal ionique, activé par l’AMPc. Elle agit également comme un régulateur de divers canaux ioniques, et est directement liée à d’autres protéines. Les différents troubles de la mucoviscidose peuvent être dus à la multifonctionnalité de la protéine CFTR, mais aussi à une altération secondaire de l’expression d’autres protéines. Pour déterminer l’importance de l’inhibition du canal CFTR dans le développement de la MV, nous avons décidé de rechercher des anomalies d’expressions protéomiques provoquées par l’inhibition de CFTR. Le travail a été conduit sur des cellules Calu-3, exprimant très fortement CFTR qui y est activée dans les conditions basales de culture. Ces cellules ont été traitées pendant 24 heures avec un inhibiteur spécifique de CFTR : le CFTRinh-172, avant l’extraction des protéines totales. Une analyse protéomique globale de ces cellules traitées a été faite dans le but de détecter les protéines différentiellement exprimées, par comparaison au protéome des cellules non traitées, au moyen de l’électrophorèse bidimensionnelle et de les identifier en spectrométrie de masse, via le MALDI-TOF. MATERIELS ET METHODES But : Analyser des modifications protéiques induites par l’inhibition du canal CFTR. Culture cellulaire : Utilisation des cellules Calu-3. Stimulation des cellules : En présence de l’inhibiteur de CFTR (CFTRinh-172 ou I172) pour les cellules traitées. Extraction protéique : Extraction des protéines totales 24 heures après la stimulation. Dosage protéique : Dosage protéique à l’aide du kit RCDC. Première dimension de l’électrophorèse bidimensionnelle : Isoélectrofocalisation (IEF). Séparation des protéines en fonction de leur charge dans une bandelette de gel. Elles sont soumises à un gradient de pH 3 à 10, sous l’influence d’un champ électrique. Deuxième dimension de l’électrophorèse bidimensionnelle : SDS PAGE. Les protéines sont séparées en fonction de leur poids moléculaire. Révélation des spots : Coloration au nitrate d’argent. Analyse des gels : Analyse informatique avec le logiciel ImageMaster 2D Platinium V5. Spottage des gels et hydrolyse des spots : Prélèvement et préparation pour l’analyse au MALDI TOF par hydrolyse trypsique des spots d’intérêt. Spectrométrie de masse (MALDI TOF) : Analyse des peptides selon leur temps de vol. Recherche dans les bases de données : Ceci permettra l’identification de la protéine d’intérêt. 10 3 RESULTATS Cellules traitées par l’inhibiteur de CFTR Cellules sans l’inhibiteur de CFTR Premier requis indispensable : Il est inutile de prétendre obtenir des résultats à partir de l’analyse de 2 gels seulement ! Ici sont représentés 2 gels qui serviront d’exemples, mais il est absolument nécessaire de procéder à une analyse statistique sur un nombre de gels suffisant (n>3). Principe de la méthode : Par comparaison des gels contrôles (protéines totales des cellules sans inhibiteur) avec les gels traités (protéines totales des cellules mises en présence de l’inhibiteur de CFTR), les protéines différentiellement exprimées sont recherchées dans un premier temps en utilisant le logiciel ImageMaster 2D Platinium V5. Il faut comparer les gels 2 à 2 (contrôles vs traités, avec bien sûr un nombre de gels suffisants pour l’étude) et regarder s’il y a une différence d’intensité des spots, témoignant alors d’une éventuelle différence d’expression (et ce, en tenant compte des différences de coloration de chacun des gels en les normalisant). Les différences doivent être reproductibles dans tous les gels pour la validation des résultats. Explication de la démarche analytique du logiciel ImageMaster 2D Platinium V5 : Le logiciel a détecté plusieurs protéines surexprimées dans les cellules traitées. L’inhibiteur de CFTR semble provoquer une augmentation de l’expression de certaines protéines (notamment dans la zone des petits poids moléculaires) En bleu : Les spots différentiels détectés dans tous les spots par le logiciel ImageMaster 2D Platinium V5. Les protéines 1 et 2 ont pu être identifiées. Protéine 2 Protéine 2 Protéine 1 Protéine 1 Analyse en spectrométrie de masse (MALDI-TOF) : Tous les spots différentiels ont été analysés après protéolyse des protéines présentes dans les morceaux de gels de manière à pouvoir identifier ces protéines grâce aux bases de données. Seulement deux protéines ont pu ainsi être identifiées (protéines en rouge) : - La protéine 1 est une hydroxyacyl coenzyme A dehudrogenase (cf. image 1) - La protéine 2 est une electron transfer flavoprotein (cf. image 2) Image 1 Image 2 Perspectives Il faudrait refaire d’autres gels pour confirmer la reproductibilité de nos expériences. Il est nécessaire de refaire d’autres gels pour une analyse en spectrométrie de masse, pour d’une part vérifier nos résultats, et d’autre part identifier de nouvelles protéines différentiellement exprimées. Tous ces résultats devront aussi être vérifiées dans des cellules de patients atteints de la mucoviscidose. Enfin, il faudrait essayer de replacer ces résultats dans le contexte de la maladie : quelle est l’implication de ces troubles dans la mucoviscidose ?