ESQUEMA GENERAL

1. SESIÓN I: TRANSFORMAR cepas de E. coli con un plásmido para que adquieran resistencia a un antibiótico SESIÓN 2: AISLAR el plásmido mediante la técnica de Lisis alcalina SESIÓN 3: FUNCIóN DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Cortar el plásmido aislado con enzimas de restricción y visualizarlo en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio ESQUEMA GENERAL

2. OBJETIVO DE LA PRÁCTICA: OBTENER BACTERIAS RESISTENTES A KANAMICINA Escherichia coli Medio LB + KANAMICINA

3. Se “introducirá el vector pET-TEM Sitio múltiple de restricción Gen que confiere resistencia a kanamicina: kanamicina fosfotransferasa Origen de replicación

4. PURIFICACIÓN PLÁSMIDOS Niveles de impurezas aceptados por la FDA Ccc: supercoiled circular covalently closed Oc: open circular

5. La diferencia en TAMAÑO entre el DNA cromosomal y el DNA plasmídico permite desarrrollar estrategias de purificación Plásmidos

6. TOPOISÓMEROS DE PLÁSMIDOS: diferentes formas de enrollamiento

7. TOPOISÓMEROS DE PLÁSMIDOS: diferentes formas de enrollamiento

8. TOPOISÓMEROS DE PLÁSMIDOS: diferentes formas de enrollamiento

9. PURIFICACIÓN PLÁSMIDOS Niveles de impurezas aceptados por la FDA Ccc: supercoiled circular covalently closed Oc: open circular

10. Purificación de plásmidos Química Mecánica Cambios en la Tempratura 1. Lisis Centrifugación Filtración (uso de membranas) 2. Remover partículas grandes Precipitación fraccionada Adsorción a membranas 3. Purificación intermedia Métodos cromatográficos: Intercambio iónico Filtración en gel Afinidad 4. Purificación alta resolución Disolver Liofilizar Formular 5. Conservar

11. ESQUEMA GENERAL DEL AISLAMIENTO DE PLÁSMIDOS POR LA TÉCNICA DE LISIS ALCALINA

12. Aislamiento de plásmidos por el método de lisis alcalina Las bacterias se dejan crecer hasta una fase estacionaria

13. Solución GTE:Glucosa/Tris-HCl/EDTA pH=7.9 La glucosa no tiene carga pero es un osmolito El EDTA une cationes divalentes como Mg2+ y Ca2+ en la membrana celular, debilitando la membrana. También el Mg2+ es cofactor de Dnasas

14. Tris-HCl Glucosa Componentes de la solución GTE

15. El NaOH desnaturaliza el DNA plasmídico y cromosomal Solución de lisis Solución de lisis: NaOH 0.2 N / SDS 1% Esta solución disuelve los fosfolípidos y los componentes proteícos de las membranas celulares. SE ROMPE LA MEMBRANA DE LAS CÉLULAS

16. Acetato de Potasio: Precipita el SDS junto con proteínas y lípidos. El DNA cromosomal que se renaturaliza se “atrapa” en el precipitado SDS/proteínas/lípidos. Sólo el DNA plasmídico y moléculas de RNA “escapan” del precipitado y SE ENCUENTRAN EN EL SOBRENADANTE

17. Incubar por 20 min a -20°C El isopropanol precipita los ácidos nucleícos Lavar el “botón” con etanol al 70%: remueve sales y remanentes de SDS. También remueve el isopropanol. La mezcla isopropanol-etanol se evapora más rápido

18. Purificación de plásmidos Por ejemplo unión al pétido 16mer NH2-Cys-Met-Lys-Tyr-Val-Ser-His-Gly-Thr-Val-Ser-Arg-Val-Val-Asn-Gln-COOH

19. ¿Cómo podríamos monitorear el progreso de la purificación de plásmidos? • Absorbancia 260 nm • Electroforesis en geles de agarosa

20. Por la electroforesis en geles de agarosa se debe monitorear la purificación de plásmidos 1 Precipitación con isopropanol 2 Cromatografía intercambío aniónico 3 Filtración con membrana de nitrocelulosa 4 Lo que se retuvo en la membrana de nitrocelulosa DNA cromosomal Plásmido abierto Plásmido superenrrollado

21. Microscopia de polímero de agarosa

22. Uso de “colorantes”

24. Tinción con Syber Safe