Cancérologie fondamentale

1. Cancérologie fondamentale Place de l’Anatomie et Cytologie pathologiques et Apport de la Biologie Moléculaire H. Sevestre B. Gubler

2. Les plateformes hospitalières de génétique moléculaire des cancers (1) La Biologie moléculaire: une nécessité Ce n’est pas (plus) un luxe dans la prise en charge des patient atteints de cancer INCa: Institut National du Cancer - Agence sanitaire et scientifique de l’état. - Développe l’expertise et finance des projets dans le domaine des cancers Plateformes hospitalières de génétique moléculaire des cancers Amiens • Mesure 21 du plan Cancer 2009-2013: • Garantir un accès égal aux traitements et aux innovations. • - Action 21.2: Développer les plateformes de génétique moléculaire des cancers et l’accès aux tests moléculaires. Plateformes hospitalières de génétique moléculaire Regroupent: - Service d’Anatomopathologie - Service de cytogénétique - Laboratoire(s) d’Oncobiologie Moléculaire - Peuvent appartenir au même établissement ou à des établissements différents. - Depuis 2006, 28 plateformes soutenues par l’INCa et la DGOS.

3. Les plateformes hospitalières de génétique moléculaire des cancers (2) • Vocation: - Réalisation des tests moléculaires innovants pour l’ensemble des patients de la région, quel que soit l’établissement où ils sont pris en charge, CHU, CLCC, CH ou établissements privés. • - Organisation d’un maillage territorial suffisant pour que les prélèvements tumoraux parvenant dans les laboratoires habituels d’anatomopathologie ou d’hématocytologie puissent être pris en charge rapidement dans une plateforme avec laquelle il existe des liens organisés. • Activité des plateformes • Activités regroupées en fonction de l’utilisation des marqueurs dans la prise en charge des patients: • 1- les marqueurs prédictifs déterminant l’accès à une thérapie ciblée; • 2- les marqueurs orientant le processus diagnostique; • 3- les marqueurs participant au diagnostic, en complémentarité de paramètres cliniques, morphologiques, biologiques ; • 4- les marqueurs pronostiques orientant la stratégie de traitement du patient; • 5- les marqueurs permettant le suivi de la maladie résiduelle.

4. La Biologie Moléculaire • Définition: • La biologie moléculaire: Discipline consacrée à l’étude des molécules porteuses du message héréditaire (ADN, ARN) de leur structure, de leur synthèse et de leur altération. • La biologie moléculaire désigne également l’ensemble des techniques de manipulation d’acides nucléiques, aussi appelées techniques de génie génétique La biologie moléculaire = outil Acides nucléïques ADN ARN Associée à différente technologie - PCR - Electrophorèse - Analyse de fragment - Digestion enzymatique - Séquençage - Snapshot - Micropuces (transcriptome, CGH-, methyl- miR-array)

5. Place de la Biologie Moléculaire Clinicien Chirurgien Anatomopathologiste Cytogénéticien Organe Tissue  Cellule Noyau  chromosomes ADN ARN Biologiste moléculaire

6. Place de la Biologie Moléculaire dans la chronologie des explorations Organe Médecin patient - Examen - Investigations Clinicien Chirurgien Excérèse, biopsie, µ-biopsie, ponction Tissue  Cellule ADN/ARN Noyau  chromosomes Anatomopathologiste Biologiste moléculaire Cytogénéticien Identification Nature - Classification Origine tissulaire Immunohistochimie Expression de marqueur • - Détection et caractérisation de translocations chromosomiques (BCR/ABL, M, m, µ) • - Détection d’anomalies infra-chromosomique • Mutation de gène. • Suivi et quantification de la MRD. Caryotype: - Anomalies de nombre - Anomalies de structure FISH - Délétion / Duplication - Translocation

7. Accessibilité de la cible Le génome Humain - 46 chromosome (44+XX ou 44+XY) - 30 000 gènes - 3,2x 109 paire de base (6,4x109/cellule diploïde) Amplifier la cible (gène d’intérêt) pour pouvoir l’individualiser et l’analyser PCR (réaction de polymérisation en chaine) - toute analyse de BM débute par un étape d’amplification 2n copies de la région cible n cycles Limites et Echecs - Quantité de matériel (µ-biopsie) - % de cellules tumorales - Hétérogénéité des cellules tumorales

8. Objectif des analyses de Biologie Moléculaire en cancérologie • La BM identifie • 1- les marqueurs diagnostiques et ou pronostiques orientant la stratégie de traitement du patient • 2- les marqueurs participant au diagnostic • 3- les marqueurs déterminant l’accès à une thérapie ciblée • 4- les marqueurs permettant le suivi de la maladie résiduelle. • 1) Les marqueurs diagnostiques et ou pronostiques orientant la stratégie de traitement du patient

9. Marqueurs orientant la stratégie de traitement du patient • L’identification d’altérations génétiques au sein des cellules cancéreuses a permis la mise en évidence de nouveaux biomarqueurs moléculaires. • Ces paramètres sont aujourd’hui indispensables pour le diagnostic, la classification, le choix et la surveillance du traitement • La mise en évidence de ces altérations a permis d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, puis de développer des thérapies ciblées contre celles-ci. Exemple princeps: Imatinib et traitement des leucémie myéloïde chronique (LMC). • La LMC est une néoplasie myéloproliférative caractérisée par la présence du chromosome Philadelphie (ch22) t(9 22)(q34;q11) à l’origine d’un transcrit de fusion (ARNm BCR-ABL) • La protéine codée par ce transcrit a une activité tyrosine kinase constitutivement dérégulée directement responsable de la transformation leucémique. • La protéine est la cible d’un inhibiteur de tyrosine kinase (ITK), l’imatinib (inhibiteur compétitif de l’ATP), dont l’efficacité thérapeutique importante a profondément transformé la prise en charge thérapeutique et le pronostic de cette hémopathie. • 88 % des patients sont désormais en vie 6 ans

10. Caryotype et marquage FISH: Exemple de t(4;11)(q21;q23) Avant translocation Après translocation Utilisation de sondes spécifiques de gènes pour l’identification de translocations t(4;11)(q21;q23) FISH MLL-AF4 MLL +AF4 • t(4;11)(q21;q23): MLL-AF4 • - 50-70% des LAL du nourisson • - 10% des LAL-B de l’adulte = LAL à haut risque pronostic très sombre intensification de traitement et allogreffe (HSCT) à la première remission complète. • Mediane de survie < 1an • - Conséquences moléculaires : genèse d’un transcrit de fusion et traduction d’une protéine Caryotype 1) Isolement des cellules du patient 2) Culture à court terme 3) Blocage des division en prométhaphase ou métaphase par addition de colchicine 4) Choc hypo-osmotique: éclatement des cellules

11. Caryotype et marquage FISH: Exemple de t(4;11)(q21;q23) (suite) t(4;11)(q21;q23) Détection: - par PCR Génomique (rarement) - par RT-PCR ADN AF4 MLL (ALL-1) MLL (ALL-1) 4q21 Chromosome 4 Primer MLL Primer AF4 PCR AF4 11q23 ARN Chromosome 11 Structure du gène AF4 : Fonction: activateur transcriptionnel Structure du gène MLL : Fonction: Activateur transcriptionnel (protéine de forte mobilité qui se lient à l’ADN

12. 2- Le suivi de la Maladie résiduelle (MRD) ou quantification des cellules tumorales persistantes

13. Suivi du transcrit MLL-AF4 par qRT-PCR avec sonde Taqman Sonde Taqman AF4 Primer spécifique MLL R Q Primer AF4 R PRINCIPE - Isolement des cellules nucléées (sang, moelle) - Extraction des ARN - Reverse transcription - Réalisation de PCR quantitative avec sonde taqman 1) Activité Polymérase R Q 1) Activité Exonucléase Q

14. Quantification de la maladie résiduelle par RQ-PCR 1/10è 1/10è 1/10è 1/10è Diagnostic Blastes = 85 to 99% Mix (3 à 5) ADN polyclonal 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 2) Quantification Log Ct Echantillon du patient Jour = X % de blastes = ? X Quantity 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 Suivi du traitement: Quantifiation de la MRD 1) courbe étalon

15. Sensibilité des techniques de Biologie moléculaire pour le suivi de la MRD Le suivi de la MRD par PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) permet - d’objectiver la réponse thérapeutique - d’anticiper la rechute

16. 3- les marqueurs participant au diagnostic

17. HPS

18. HPS 2

19. IMMUNOMUM1 CD30

20. IMMUNOCD15 CD20

22. HPS LEVRE

23. IMMUNO CD30 PANLEUCO

24. HIS EBER

25. CD117

26. HPS BOM

27. BOM IMMUNOCD30 CD20

28. B.O.M. HIS EBER

31. IMMUNOCD30 CD3

32. Marqueurs participant au diagnostic: Exemple du diagnostic de clonalité lymphoïde Sous types et loci Lymphocytes B Plasmocytes IgH Ig membranaire (BcR) Isotype kappa IgL Activation Maturation Prolifération Isotype M, D, G, A, E Anticorps Ig solubles Isotype lambda Cytologiste ou pathologiste - Morphologie - Isotype - Marqueurs membranaires ou intracellulaires Biologiste moléculaire 3 loci: réarrangements IGH, IGK et IGL Lymphocytes T Sous populations Sous types et loci TcR Sous populations corécepteur - T CD8+ - T CD4+ TCRab TCRgd Biologiste moléculaire 4 loci: réarrangements TCRA, TCRB, TCRG et TCRD

33. Clonalité lymphoïde à l’échelle de l’organisme 1) Polyclonal 109 à 1012 lymphocytes différents qui se distinguent par l’Ig ou le TCR qu’ils synthétisent 2) Oligoclonalité Lymphocytose réactionnelle - Infection - Chronicité 3) Monoclonalité au sein d’une population Polyclonale A surveiller 3) Monoclonalité

34. Identification des réarrangements des gènes du TCRg par PCR V 1 2 3 4 5 5P 6 7 8 A 9 10 B 11 C1 C2 JP1 JP J1 JP2 J2 3’ 5’ 120kb 2 J1 TRGV2 Germinal J1 RSS RSS Forward Primer TCRGV Reverse Primer JG Recombiné Forward Primer TCRGV Reverse Primer JG Absence d’amplification Amplification Produit de PCR • PRINCIPE • - Isolement des cellules nucléées (sang, moelle, biopsie, LCR …) • Extraction de l’ADN • Réalisation de PCR multiplex ciblant les locus des Igs et TCR

35. L’amplification et l’analyse des produits de PCR dépend de plusieurs paramètres V 1 2 3 4 5 5P 6 7 8 A 9 10 B 11 C1 C2 JP1 JP J1 JP2 J2 1) Multiplicité des gènes V et J 5’ 3’ 2) Multiplicité des combinaisons possibles V1J1; V1J2; V1JP; V1JP1; V1JP2, V2J1; V2J2 …… Ect…. 3) Diversité jonctionnelle Coupure aléatoire Addition aléatoire de nucléotides (TdT) Délétion des nucléotides en 3’ des gènes V Insertion nucleotides Délétion des nucléotides en 5’ des gènes J V deletion 0 -1 -2 -3 ect Insertion 0 +1 +2 +3 ect J deletion 0 -1 -2 -3 ect Variation de la taille des produits de PCR = 15 à 45 pb  Analyse en agarose non apropriée  Analyse sur Genetic Analyzer (séquenceur) et Sizing  PAGE PCR Multiplex : Amorces sens: Consensus V (TRGV) Amorces antisens: Consensus J (TCRG JG + TCRG JP)

36. Etude des réarrangements des gènes des Immunoglobulines et du TCR 800 160 170 180 190 200 210 220 230 240 700 600 500 400 300 200 L 1 2 3 100 0 Tissu polyclonal 4800 4200 7680 3600 6720 3000 2400 5760 1800 1200 4800 600 3840 0 2880 Expansion Monoclonale dans Tissu polyclona 1920 980 0 Expansion monoclonale Analyse des produits de PCR par électrophorèse capillaire sur séquenceur Genscan Produits de PCR Cellules PAGE

37. Marqueurs participant au diagnostic – ex du diagnostic de clonalité lymphoïde Produits de PCR Cellules Tissu polyclonal Expansion oligoclonale Recours à l’étude des réarrangement des gènes des Ig et du TCR lorsque - Immunohistochimie ou cytométrie de flux insuffisamment informative Exemples - Lymphocytose monoclonale / Lymphocytose réactionnelle - Lymphome T riche en B

38. 4) les marqueurs déterminant l’accès à une thérapie ciblée

39. LE CAS DU CANCER BRONCHO-PULMONAIRE • DIAGNOSTIC HISTOPATHOLOGIQUE, PARFOIS SUGGERE PAR ETUDE CYTOPATHOLOGIQUE • PARFOIS DIFFICILE D ACCEDER A LA LESION (NODULE PERIPHERIQUE) • DIAGNOSTIC TARDIF, SOUVENT AU STADE METASTATIQUE • TRAITEMENTS GENERAUX, CIBLES

40. BIOPSIE BRONCHIQUE

41. AIDE AU DIAGNOSTIC D ADK : TTF1

43. FISH : CASSURE EML4-ALK

44. Thérapeutiques ciblées (1): 1) Caractéristiques des cellules tumorales • Contrôle génétique de la division cellulaire • La division cellulaire est régulée, positivement et négativement, par l’expression de nombreux gènes. • Tout gène pouvant devenir transformant par mutation ou par surexpression est un oncogène Le CANCER est dû à des ALTERATIONS GENETIQUES qui perturbent la physiologie et l’équilibre entre stimulation et inhibition de la prolifération et de la survie cellulaire Ces mutations se traduisent par: • Indépendance vis-à-vis des signaux de prolifération • Perte de contrôle du cycle cellulaire • Perte des capacités de mort cellulaire programmée (apoptose) • Acquisition du phénotype d’immortalité des lignées cellulaires • Développement de capacités d’invasion et de métastase • Mise en place d’une angiogénèse spécifique à la tumeur

45. EGF TGF-a HB-EGF EPR EPG AR Les récepteurs de la famille HER (HER=Human EGF Receptor) D’après Shepard HM, et al, J Clin Invest. 2008 Nov;118(11):3574-81. Review. EGFR HER2 • Famille de récepteur ubiquitaire • 4 membres (plus variants par épissage alternatif): EGFR (ou HER1), HER2, HER3, et HER4. • EGFR, HER2, et HER4 ont un domaine tyrosine kinase (TK) activé par oligomerization. • - 11 types de ligands (certains également générés par épissage alternatif (ex: les neuregulines [NRGs]) NRG1 NRG2 TK TK TK TK EGF TGF-a HB-EGF EPR EPG BTC AR HER3 EPG NRG1 NRG2 TK TK TK EGFR HER1 ErbB1 HER2 HER2/neu ErbB2 HER3 ErbB3 HER4 ErbB4 HB-EGF EPR EPG BTC AR NRG1 NRG2 NRG3 NRG4 Domaine De fixation du ligand HB-EGF EPR BTC AR NRG1 NRG2 NRG3 NRG4 Domaine TM TK Domaine Tyrosine kinase TK TK TK HER4 La fixation d’un ligand induit l’oligomérisation dont le résultat est la stimulation de l’activité tyrosine kinase qui conduit à l’activation des voies de signalisation en aval, en particulier les voies RAS/MAP-K et PI3K/Akt. AR, amphireguline; BTC, betacelluline; EPG, epigen; EPR, epireguline; HB-EGF, heparin-binding EGF. TK TK TK

46. Les Voies de signalisation des récepteurs de la famille HER EGFR, HER2, HER3, HER4 Ligand P P Ras PI3K STATs PKC Raf PTEN Voie RAS/MAPK AP1 Voie STAT AKT Mek1/2 Voie PI3/AKT Erk1/2 mTOR Bad F. Transcription c-myc c-fos c-jun MAPK Progression du cycle cellulaire Apoptose Prolifération Transcription de gènes

47. Conséquences des perturbations des voies de transduction du signal par les HER • Origine des perturbations • 1) Les récepteurs • Hyper-expression des récepteurs • Mutations des récepteur entrainant • Indépendance vis-à-vis du ligand • Auto-phosphorylation HER GRB P P SOS RAF PI3K RAS STAT Voie PI3/AKT MEK Voie RAS/MAPK Voie STAT PTEN AKT MAPK Transcription de gènes Progression du cycle cellulaire Cycline D1 ADN Myc Cycline D1 Jun/Fos • 2) La cascade signalisation • Mutations de KRAS, BRAF, MEK, STAT PI3K etc… Myc Prolifération vs Maturation Survie vs Apoptose Angiogénèse Métastase

48. Thérapeutiques ciblées (2): Mécanismes impliqués dans l’oncogenèse = Cibles thérapeutiques M • Spécifiques des cellules tumorales • => meilleure tolérance • => nouveaux modes d’action : • – Bloquer la néoangiogenèse • – Bloquer la prolifération • – Bloquer la dissémination • – Action cytotoxique additionnelle pour certaines • thérapeutiques ciblées (rituximab, trastuzumab) G1 G2 S Angiogenèse Protection vis-à vis de signaux pro-apoptotiques Cascade de signalisation Perte d’adhérence cellulaire Migration Capacité d’invasion Métastase Activation de Gènes Prolifération cellulaire - Perte de contrôle du cycle cellulaire - Indépendance vis-à-vis des facteurs de croissance Dédifférenciation immortalisation Les voies de la signalisation comme cible pour le développement de nouvelles molécules anticancéreuses

49. Une même cible, des cancers différents, des approches différentes Exemple de HER2 Récepteur Tyrosine-kinase (RTK). La famille HER compte 4 membres: - epidermal growth factor receptor (EGFR, also called HER-1 or erbB-1) - HER-2 (erbB-2 ou Neu) - HER-3 (erbB-3) - HER-4a (erbB-4). http://atlasgeneticsoncology.org/Genes/ERBB2ID162ch17q11.html

50. Les thérapies ciblant la transduction du signal par les récepteur HER Anticorps anti-récepteur Molécules inhibitrices de l’activité tyrosine kinase Couplage Ligand-Toxine Ligand Ligand Ligand EGFR, HER2 HER3, HER4 TKi P P P P P P Blocage de la transduction du signal Induction de l’apoptose