Eksperimenta metodes bioloģijā

1. Eksperimenta metodes bioloģijā 5. lekcija 2012./2013. mācību gada 1. semestris Māris Lazdiņšlazda@latnet.lv LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

2. Proteomika (1995/94, Marc Wilkins) - visu proteīnu kopums • Organismā • Noteiktos audos (cilvēka serumā ap 1 500 dažādu proteīnu) • Noteikta tipa šūnās • Noteiktās šūnas daļās (mitohondrijs, hloroplasts) - translokācija no citoplazmas uz membrānu, uz noteiktiem organoīdiem. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

3. Proteomika - noteikta proteoma izpēte. To var definēt arī kā gēnu ekspresijas pētījumus proteīnu līmenī. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

4. + / - Plusi un mīnusi Genomika un transkriptomika prognozē - kāds būs proteīns, - cik daudz tas būs, - kādas modifikācijas ar to var notikt. Proteomika skaidri parāda, kas tad īstenībā ir noticis - cik daudz un kāda veida proteīni atrodami šūnā, dažādās tās vietās. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

5. + / - Plusi un mīnusi Genomika un transkriptomika patreiz vieglāk realizējamas. Nukleīnskābēm vieglāka: - sekvences noteikšana, - pavairošana (PCR, RT-PCR), - kvantitēšana (Q-PCR, "čipi"), - citas ērtas DNS, SNP analīzes metodes (hibridizēšana, šķelšana ar saitspecifiskām endonukleāzēm - RFLP, mikrosekvenēšana, SSCP, DDG u.c.) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

6. Proteomika Izmanto dārgas un sarežģītas tehnoloģijas. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

7. Uzdevumi var būt dažādi: • Sākot no statistiskas (bioinformātiskas) dažādu organismu proteomu salīdzināšanas; • Ietverot proteoma dinamikas izpēti atkarībā no: • fizioloģiskā stāvokļa, • patoloģijas, • attīstības stadijas, • atbildē uz vides faktoriem (barības vielas, stresa faktori, noteiktu savienojumu / medikamentu iedarbība). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

8. Uzdevumi • Beidzot ar konkrētu proteīnu un to modifikāciju identificēšanu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

9. Uzdevumi Salīdzinošā proteomika Proteoma dinamikas izpētei tiek pievērsta vislielākā uzmanība – tā ļauj atklāt proteīnus, kuru daudzums šūnā mainās: • Slimības gadījumā (jauni slimību marķierproteīni asinīs, urīnā) • Dažādās slimības stadijās (subklasifikācija, prognozes) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

10. Uzdevumi • Salīdzinošā proteomika • Šūnu stresa gadījumos, • Pēc ģenētiskām manipulācijām, • Izmaiņām metabolismā, • Iespējama izmaiņu laika noteikšana: LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

11. Uzdevumi Salīdzinošā proteomika Straujās izmaiņas (mazak kā 15 min. laikā [eikariotiem] ) • saistītas ar jau ekspresētu proteīnu mijiedarbību: • Translokāciju, • Fosforilēšanu, • Defosforilēšanu, • Proteolīzi. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

12. Uzdevumi • Salīdzinošā proteomika Lēnās izmaiņas (vairāk kā 15 min. laikā [eikariotiem]) • saistītas ar gēnu ekspresijas aktivēšanos inaktivēšanos: Ļauj atklāt un izsekot šūnas signālceļu darbībai, secīgi iesaistītajiem ķēdes locekļiem. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

13. Uzdevumi Salīdzinošā proteomika • Ļauj izsekot šūnu atbildei uz medikamentiem (iedarbības prognozes, toksiskums). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

14. Uzdevumi Farmakoproteomika Daudzu slimību gaitu var ietekmēt, specifiski iedarbojoties uz noteiktiem proteīniem – mērķis medikamentiem. Domā, ka pavisam varētu būt ap 10 000 šādu proteīnu. Patreiz zināmi ap 500. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

15. Proteomikaspamatmetodes LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

16. Pamatmetodes Sagrauj šūnas un veiksmīgi izdala visu proteīnu kopu, nekaitējot noteiktiem proteīniem, tos nepazaudējot. Attīra proteīnus no citiem savienojumiem un iegūst totālu šūnas proteīnu šķīdumu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

17. Pamatmetodes Proteīnus sadala ar augstas izšķirtspējas 2D-PAAGE (divdimensiju gelelektroforēze poli-akrilamīda gelā) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

18. 2D-PAAGE Vispirms veic parauga proteīnu sakārtošanu ar izoelektriskās fokusēšanas (IEF) palīdzību (1. dimensija) Pēc tam izmanto denaturējošo proteīnu gelelektroforēzi, lai tos sakārtotu atbilstoši molekulu masai (2. dimensija) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

19. 2D-PAAGE (IEF) pH2 pH11 H2O –2e->2H++ O0H2O +1e-> OH-+ H0 Elektrolīzē radītie joni migrē uz pretējo elektrodu. +- starts LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

20. IEF Pie pH vērtībām, kuras mazākas par proteīna pI vērtību, tie uzlādējas pozitīvi, bet pie pH vērtībām, kuras lielākas par proteīna pI vērtību, tie uzlādējas negatīvi. pI=8+pH=7pI=6 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

21. IEF Ja pI=pH, proteīna molekula zaudē lādiņu un uz elektrisko lauku vairs nereaģē. pI=7pH=7pI=7 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

22. 2D-PAAGE (IEF) Elektrolīzes radītais pH gradients ir ļoti nestabils. Šādu gradientu nepieciešams stabilizēt ar savienojumiem: - kuriem piemīt vides pH buferējošas īpašības, - kuri spēj sakārtoties, veidojot pH gradientu. Amfolīti, imobilīni LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

23. 2D-PAAGE (IEF) Amfoteriskas molekulas pH gradientā sakārtosies atbilstoši savam pI. Savienojumi ar labu buferējošo kapacitāti izveidos pH plato ap savu pI. Ja vidē pievienotas daudzas šādas molekulas ar dažādiem pI, to veidotie plato vienmērīgi pārklās visu darbības lauku, veidojot vienmērīgu un stabilu pH gradientu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

24. 2D-PAAGE (IEF) Šādus savienojumus iegūst sintētiski un to kopas sauc par amfolītiem (Ampholytes). Amfolītu sastāvs nosaka, kāds pH gradients sitēmā tiks izveidots. Vienu amfolītu komplektu veido vairāki simti vai pat vairāki tūkstoši dažādu amfolītisko savienojumu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

25. 2D-PAAGE (IEF) Sākotnējam skrīningam izmanto plaša pH diapazona amfolītus (parasti pH 3-10). Ja interesē neliels pH diapazons, var izvēlēties amfolītu komplektu 2 pH vienību diapazonā. IEF ainas kvalitāti mazina difūzijas process. pH6 pH8 +- starts LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

26. 2D-PAAGE (IEF) Izšķir divus IEF paveidus: • NEPHGE (non equilibrium pH gradient electrophoresis) • Izmanto amfolītus +laba izšķirtspēja – līdz 10 000 punkti uz 2D gela, -grūtāk izpildāma un standartizējama. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

27. 2D-PAAGE (IEF) Izšķir divus IEF paveidus: • IPG (immobilized pH gradient) - pH gradients iestrādāts gatavā gelā ar imobilīnu (gelam kovalenti saistīti amfolīti) palīdzību. - zemāka izšķirtspēja – uz 2D gela var iegūt līdz 2 000 punktus + vieglāk izpildāma, + laba atkārtojamība. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

28. 2D-PAAGE (IEF) Multiphor II. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

29. 2D-PAAGE (IEF) IPGphor. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

30. 2D-PAAGE (IEF) Gela sloksnīšu uzlikšana LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

31. 2D-PAAGE (IEF) Sagatavošana paraugu uznešanai LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

32. 2D-PAAGE (IEF) Paraugu uznešana LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

33. 2D-PAAGE (IEF) Gela sloksnīti ar IE fokusetajiem proteīniem iepolimerizē vai novieto uz vertikāla SDS PAA gela. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

34. 2D-PAAGE (IEF) Parasti izmanto daudzgelu gelelektroforēzes iekārtas. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

35. Proteīnu krāsošana un identificēšana - - nākamajā sērijā... LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML