Analytická fáze klinicko - biochemického vyšet ř ení pacienta

1. Analytická fáze klinicko - biochemického vyšetření pacienta Ing. Andrea Gruberová Doc. MUDr. Petr Čechák, CSc. Ústav biochemie a pathobiochemie FNKV a 3 LF UK 2006/2007

2. Fáze laboratorního vyšetření : • preanalytická - definována jako postupy a operace od požadavku na vyšetření až po zahájení analýzy vzorku, tj. skládá se z přípravy nemocného na odběr vyšetření, odběru biologického materiálu, jeho uchování a transportu do laboratoře • analytická - je prováděna v laboratoři v souladu s postupy správné laboratorní praxe - zahrnuje vnitřní a vnější kontrolu kvality, které by měly minimalizovat chyby analytického procesu • postanalytická - Jedná se o interpretaci výsledků stanovení ve vztahu k fyziologickým hodnotám (bývají udávány jako referenční meze), k výsledkům dalších vyšetření laboratorního komplementu a zobrazovacích metod a ke klinickému obrazu pacienta (anamnéze, objektivnímu nálezu)

3. Časové rozdělení jednotlivých fází biochemického vyšetření

4. Analytickáfáze laboratorního vyšetření • Jedná se o tu část laboratorního vyšetření, která je doménou laboratoře, tj. o vlastní analýzu. • Je zajišťována analytickými chemiky, biochemiky a zdravotními laboranty a prováděna v souladu s postupy správné laboratorní praxe (interní a externí kontrola kvality). • Stanovení daného analytu může být prováděno celou řadou metodik, tj. analytických postupů, které ovšem mohou mít různou vypovídací hodnotu. S rozvojem řady technologií v našem století se přesnost a spolehlivost metod výrazně zvýšila. Příkladem může být stanovování stopových prvků, kdy v průběhu dvaceti let normální hodnoty poklesly až stonásobně.

5. Druhy biologického materiálu v laboratoři : • sérum - nažloutlá tekutina, která vzniká po sražení krve (krevní buňky s některými bílkovinami vytvoří koagulum a s. je vytlačeno ven). Je podobné plasmě, ale neobsahuje některé bílkoviny, které jsou nutné ke vzniku sraženiny a které se při její tvorbě spotřebovaly • plasma - nažloutlá tekutina, která je spolu s krvinkami v ní obsaženými základem krve. Obsahuje 90 % vody, 8 % bílkovin (albumin, globuliny, fibrinogen, koagulační faktory, imunoglobuliny aj.), soli, glukosu, lipidy, žlučová barviva, hormony, vitaminy, odpadní látky aj. • - lze získat odstředěním nesrážlivé krve, tj. krve odebrané do stříkačky nebo zkumavky obsahující protisrážlivé látky – citrát nebo heparin • punktát – materiál získaný punkcí • moč • likvor • stolice • slzy

6. Metody (podle principu) : • chemické • fyzikální • imunochemické • m. vyšetřování nukleových kyselin • chromatografické

7. Metody chemické : • optické • elektrochemické • elektroforetické

8. Metody optické : • Absorpční fotometrie • zabývá se kvantitativním hodnocením změny intenzity záření po průchodu analytickým prostředím • absorbance je přímo úměrná látkové koncentraci a tloušťce absorbující vrstvy • platí Lambertův-Beerův-Bougnerův zákon : A = a . c . l A . . . absorbance a . . . absorpční koeficient pro danou λ (vlnová délka) c . . . koncentrace roztoku l . . . délka optické dráhy (tloušťka vrstvy roztoku) - přístroje : - jednopaprskové - absorpční fotometry - dvoupaprskové roztok spektrofotometry blank (slepá zkouška) s rozvojem automatických analyzátorů výzkum

9. Metody optické – pokračování : • Reflexní fotometrie– sleduje se odražené záření od homogenně zbarvené podložky - použití : pro kvantitativní vyhodnocení reakcí probíhajících na pevné fázi se suchými činidly po jejich aktivaci vodou obsaženou v měřeném vzorku • Plamenová emisní fotometrie– měří se intenzita zbarvení plamene, k emisi záření charakteristické délky dochází při návratu elektronů z excitovaného stavu (vyvolaného plamenem) na původní dráhy použití : pro stanovení koncentrace sodných a draselných iontů v séru či v moči, lithia a vápníku nátrémie - závislá na obsahu bílkovin a lipidů v plazmě kde se patologicky zvyšují falešně snížená nátrémie (tzv. pseudohyponátrémie)

10. Metody optické – pokračování : • Fluorimetrie– využívá se jevu, kdy v některých látkách po ozáření dostatečně energetickým zdrojem světla vzniká fotoluminiscence; látky při tom vyzařují světlo, jehož intenzita je přímo úměrná koncentraci fluoreskující sloučeniny Použití : zejména pro detekci v imunochemii • Turbidimetrie– založená na měření procházejícího světla zeslabeného rozptylem na částicích • měří se stupeň zákalu - turbidita - použití : imunochemické metody • Nefelometrie– měření intenzity difuzně rozptýleného světla na dispergovaných částicích • rozptýlené světlo vychází z roztoku všemi směry a měří se pod úhlem, který je odlišný od směru dopadajícího záření - použití : pro reakce antigen-protilátka, je o řád citlivější než turbidimetrie

11. Metody optické – pokračování : • Chemiluminiscence– excitace fotonů je vyvolána chemickou reakcí, která proběhne buď po nástřiku syntetizovaného činidla, nebo se použije biologická substance (bioluminiscence) nebo se k excitaci činidel využívá oxidace na anodě (elektrochemiluminiscence) • přímá emise fotonu z excitovaného produktu obvykle poskytuje krátké záblesky světla, zatímco transfer energie na fluoreskující sloučeniny se většinou projevuje jako dlouhodobá (v minutách) světelná emise

12. Elektrochemické metody : • Potenciometrie– měří se rozdíl potenciálů (napětí) mezi dvěma elektrodami; jedna elda – referenční (srovnávací) – konstantní potenciál; druhá elda – indikační (měrná) – potenciál závisí na aktivitě měřeného analytu ve zkoumaném vzorku - použití : stanovení sodných, draselných, lithných, vápenatých, hořečnatých a amonných kationtů, chloridových aniontů a oxid uhličitý - pH - astrup - skleněná elda - ISE • Ampérometrie– měření proudu za konstantního potenciálu - amperometr slouží jako detektor elektronů v oxidačně-redukčních reakcích při stanovení glukozy, sleduje se množství elektronů uvolněných při doprovodné reakci Fe2+ Fe3+ + e- všechny moderní glukometry

13. Elektrochemické metody - pokračování : • Polarografie– měří se intenzita proudu při konstantním vnějším potenciálu (přepětí) Clarkova Elda – slouží ke stanovení množství kyslíku; kyslík rozpuštěný ve vzorku nebo v pufru difunduje přes hydrofobní membránu propustnou pro plyny ke katodě (z platiny), jako anoda slouží Ag/AgCl elda; použití u acidobazických analyzátorů k měření parciálního tlaku kyslíku • Coulometrie– ke stanovení koncentrace v roztoku se používá měření prošlého náboje při elektrochemické reakci - použití : Stanovení chloridů, ale většinou se neužívá, vyžaduje separátní zpracování vzorku (na Cl- se používá spíše fotometrické stanovení) • Konduktometrie– založená na měření vodivosti analyzovaného roztoku, měří se vodivost mezi dvěma platinovými elektrodami - elektrická vodivost roztoku závisí na koncentraci iontů, jejich pohyblivosti, disociaci a teplotě roztoku - použití : pro stanovení močoviny a hematokritu a zejména pro sledování čistoty destilované vody

14. Elektroforetické metody : • Zónová elektroforeza– založena na rozdílu pohyblivosti částic látky v elektrickém poli, která závisí na velikosti náboje, velikosti molekul a vlastnostech prostředí - jako nosič se využívá acetylcelulóza nebo různé gely (agarový, agarózový nebo polyakrylamidový) - dělení na acetylcelulózových, agarových a agarózových fóliích – dochází k distribuci podle velikosti náboje; po ukončení dělení se jednotlivé složky fixují a barví; pak se fólie odbarví, popř. zprůsvitní a vysuší - dělení na polyakrylamidovém gelu – látky se dělí nejen podle elektrického náboje, ale i podle velikosti molekul; efekt molekulového síta – polyakrylamidový gel s gradientem hustoty, přidá se laurylsíran sodný (SDS) a všechny molekuly mají téměř stejný náboj a dělí se jen podle velikosti - vyhodnocení – provádí se na denzitometru – elektroforeogram se automaticky posunuje nad štěrbinou, kterou prochází světlo zvolené vlnové délky; v místě frakcí dochází k částečné absorpci záření; to se projeví při jeho dopadu na čidlo a převodu signálu na analogový záznam; po zpracování integrátorem získáme číselné výsledky jednotlivých elektroforetických frakcí - použití : ke stanovení frakcí bílkovin, lipoproteinů, glykoproteinů a jednotlivých izoenzymů

15. Fyzikální metody : • Osmometrie– měření osmolality v séru a moči - osmotický tlak – tlak rozpuštěných, zejména nízkomolekulárních látek a iontů v roztoku odděleném polopropustnou membránou od samotného rozpouštědla - přímo úměrný celkovému počtu rozpuštěných nebo disociovaných částic - pokud látka disociuje každá disociovaná část je osmoticky aktivní částicí - nedisociovaná látka - jen jedna osmoticky aktivní částice - osmolalita (mmol/kg)– látková koncentrace osmoticky aktivních částic v 1 kg rozpouštědla - orientační výpočet osmolality : osmolalita = 2 [Na+]+[močovina]+[glukóza]

16. Fyzikální metody - pokračování : • Onkometrie • onkotický tlak - koloidně osmotický tlak plazmatických bílkovin • v kPa • onkometry v KB - použití vzácně, většinou součástí přístrojové výbavy jednotek intenzivní péče a ARO

17. Chromatografické metody : • Chromatografie na tenkých vrstvách– využívá se principu rozdělovací, adsorpční, ionexové i afinitní chromatografie - vzorky se nanášejí pipetou na hliníkovou fólii s litým silikagelem nebo oxidem hlinitým a vyvíjí se v chromatografické komoře v soustavě rozpouštědel • v klinické biochemii se používá méně než v minulosti a dává se přednost exaktnějším metodám • Plynová chromatografie– mobilní fáze je plynná a také separované složky jsou v plynném stavu - stacionární fáze může být tuhá látka (separace na principu adsorpce nebo sítového efektu) nebo kapalina zakotvená na nosiči (rozděluje se složka mezi kapalnou stacionární a plynnou mobilní fázi) - stacionární fáze v obou případech působí selektivně na jednotlivé separované látky a na základě vzájemných interakcí dochází k rozdělení (retenci, zadržování) jednotlivých složek v koloně k jejich rozdílné eluci - rozdělené složky jsou unášeny nosným plynem z kolony a jejich množství je zaznamenáváno detektorem

18. Chromatografické metody - pokračování : • Kapalinová chromatografie– mobilní fáze je kapalná • v chromatografických kolonách • látky se dělí ve dvoufázovém dělícím systému na základě adsorpce, výměny iontů, fyzikální distribuce látek mezi kapalnou mobilní a s ní nemísitelnou kapalnou stacionární fází nebo na principu pronikání molekul z mobilní fáze do pórů tuhých částic, které mají funkci molekulového síta

19. Metody imunochemické : • založeny na principu reakce antigen – protilátka • Protilátka se váže na antigen biospecifickou vazbou • Antigen – vysokomolekulární látka, která je schopná vyvolat v živém organismu imunitní odpověď, namířenou specificky proti použitému antigenu - bílkoviny, glykoproteiny, polysacharidy a lipopolysacharidy, nukleotidy • Protilátky (imunoglobuliny) – bílkoviny, vykazující specifickou vazebnou aktivitu vůči antigenu, na jehož podnět se v organismu vytvořily - jejich úkol – chránit organismus proti infekci - glykoproteiny

20. Metody vyšetřování nukleových kyselin : • založeny na studiu DNA (resp. RNA) • Metoda PCR – polymerázová řetězová reakce • pomocí ní měříme několik kopií některé DNA sekvence lidského genomu amplifikací pomnožení, mnohonásobné kopírování - proces, kdy z několika málo kopií jedné molekuly (sekvence nukleotidů) získáme milion- i vícenásobek

21. Metody : • kvalitativní- drogy, těhotenské testy princip sendvičové analýzy • kvantitativní • semikvantitativní– vypovídá už také o množství hledané látky - hodnocení - pomocí arbitrálních jednotek (0, 1, 2, 3, 4) - hodnocení na kříže - interval ohraničený kvantitativními hodnotami koncentrace - obvykle subjektivní vizuální hodnocení - nejčastěji proužky, zkumavky, jamky mikrotitračních destiček, plotny pro tenkovrstevnou chromatografii, jednoúčelné zkumavky, sklíčka … - detekce - oko, mikroskop, reflexní fotometrie, infračervená spektrofotometrie, kapilární elektroforéza atd.

22. Jednotky v klinické biochemii : Mezinárodní soustava jednotek SI – přijata v roce 1977 Použití jednotek: většina analytů – v látkové koncentraci (mmol/l, mikromol/l,nmol/l) všechny bílkoviny – v hmotnostní koncentraci (g/l, mg/l) hemoglobin – v hmotnostní koncentraci (g/l) enzymová aktivita – mikrokat/l, nkat/l parciální tlaky pO2 a pCO2 – kPa

23. Rozdělení vyšetřovacích metod • „Mokrá chemie“ – reakce dvou roztoků • „Suchá chemie“ – reakce na tzv. stripu

24. „Mokrá chemie“

25. „Mokrá chemie“

26. „Suchá chemie“

27. „Suchá chemie“ • kolorimetrie rozdělovací vrstva reakční vrstva semipermeabilní membrána detekční vrstva nosná vrstva

28. potenciometrie iontově-selektivní membrána referenční vrstva elektroda Ag/AgCl

29. imunologie rozdělovací vrstva reakční vrstva gelová vrstva nosná vrstva

30. SOP

31. Metody stanovení glukozy • MS s izotopovým zřeďováním • Hexokinásová metoda (referenční metoda) • Glukosaoxidasová metoda • Glukosadehydrogenasová metoda • Elektrochemické metody

32. 1. MS s izotopovým zřeďováním • ke vzorku se přidá známé množství glukozy, značené uhlíkem 14C • složitým způsobem se provede derivatizace glukozy • těkavý derivát se separuje plynovou chromatografií • hmotnostní spektrometrií se určí poměr glukozy 12C a 14C • z poměru izotopů a známého přídavku lze určit koncentraci glukozy ve vzorku • vyžaduje speciální vybavení • trvá 2 dny • nejblíže se dělá v Německu

33. 2. Hexokinázová metoda • katalýzy hexokinásou : fosfátová skupina z ATP se váže na glukozy • katalýza glukosa-6-fosfátdehydrogenasou : oxidace glukosa-6-fosfátu na 6-fosfoglukonát - oxidační činidlo NADP+ se přitom redukuje na NADPH2 růst absorbance při 340 nm • referenční metoda • vysoká specifita reakce • stanovení ruší hemolýza a léčiva absorbující v UV

34. 3. Glukosaoxidasová metoda • ß-D-glukosa je oxidována FAD na 5-glukonolakton za katalýzy glukosaoxidasou • redukovaná forma FADH2 se vzdušným kyslíkem samovolně oxiduje zpět na FAD a O2 se redukuje na H2O2 • vznikající 5-glukonolakton samovolně hydrolyzuje na kyselinu glukonovou • Trinderova reakce – POD katalyzuje oxidaci různých chromogenních akceptorů peroxidem vodíku • zbarvení obvykle červené • nejpoužívanější reakce v českých zemích

35. Trinderova reakce

36. 4. Glukosadehydrogenasová metoda • glukoza se může oxidovat na 5-glukonolakton také pomocí NAD+ za katalýzy glukosadehydrogenasou • oxidační činidlo se redukuje na NADH2 odpovídající přírůstek absorbance se sleduje při 340 nm • v česku se nevyužívá, v USA ano

37. 5. Elektrochemické metody • úbytek O2 při oxidaci glukosy v přítomnosti GOD a katalasy lze sledovat polarograficky Clarkovou kyslíkovou elektrodou (analyzátory Beckman) • využití enzymové elektrody s imobilizovanou GOD na elektrodové membráně (analyzátory Eppendorf)

38. Vztah mezi koncentrací/aktivitou a signálem • Koncentrace – vyjadřuje se v hmotnostních nebo objemových jednotkách • Aktivita – definovaný účinek za definovaných podmínek • Matematický vztah – jednoznačný a za definovaných podmínek stejný analysa je možná – užití standardů a kontrol

39. Kalibrace a kontroly • Kalibrace – standardy opřené o referenční metody stanovení obsahu • Kontroly – analysované referenčními metodami nebo standardisovanými metodami na více pracovištích • Kalibrace a kontroly – stejné chování jako měřené vzorky

40. Statistika v analýze : • Průměr • Rozptyl • Standartní směrodatná odchylka • Chyby měření : - hrubé - vznikají selhání pracovníka nebo přístroje nebo použitím nevhodné metody analýzy - vznikají obvykle jednorázově v důsledku vyjímečné příčiny - systematické - soustavné, s konkrétní předvídatelnou příčinou - stálý charakter, známá příčina - náhodné - zcela nepravidelně, v důsledku působení náhodných vlivů - ovlivňují přesnost výsledku • Správnost • Přesnost • Systém kontroly kvality (vnitřní a vnější) – další seminář

41. Vývoj v analytické chemii • Eliminace vlivu ruční práce na výsledek měření • Programové automaty s využitím PC • Metody standardisované, referenční • Standardy opřené o referenční materiály/metody • Kontrolní laboratorní systém se opírá o vhodné kontrolní materiály (fy Bio-Rad, SEKK, Instand) • Dokumentace metod - SOP

42. Výstup výsledků : • - přepis ze sešitu do LIS • - přenos on-line z přístrojů do LIS • Kontrola a editace výsledků LIS, NIS • Dynamické sledování výsledků • Papírová dokumentace – pro lékaře - pro laboratoř – hlavní kniha, pracovní listy a sešity, výtisky archivace dat

43. Děkuji za pozornost !