Systematische Identifizierung eines Arzneistoffgemisches

1. Systematische Identifizierung eines Arzneistoffgemisches Seminar zum Praktikum Pharmazeutische Chemie III

2. Allgemeine Vorgehensweise Vorproben Identifizierung und ggf. Abtrennung des Trägers Ausschütteln in verschiedene Gruppen (Stas-Otto-Trennungsgang) Systematische Dünnschichtchromatographie (evtl. Detektion) Identifizierung der isolierten Arzneistoffe • Gruppenreaktionen • Spezielle Reaktionen • IR-Spektroskopie und andere analytische Methoden

3. Vorproben • Organoleptische Prüfungen • Löslichkeitsversuche • Färbung in bestimmtenSäuren oder Basen • Farbreaktionen

4. Organoleptische Prüfungen • Farbe • Geruch manche Substanzen besitzen charakteristischen Geruch, dieser kann auch erst beim Glühen entstehen z.B. Zucker u. andere Kohlenhydrate entwickeln Karamellgeruch ocker gelb Tetracyclin Menadion

5. Löslichkeit • in NaOH: • Carbonsäuren • Phenole • ASS, Penicilline • Clioquinol Beispiele?

6. Löslichkeit • in H2SO4: • Basen • Atropin, Chinin, Lidocain Beispiele?

7. Färbung in bestimmten Säuren oder Basen Beispiele? • NaOH • H2SO4 • HNO3 Hellgelb Orange

8. Farbreaktionen • mit Froehdes Reagenz • mit Mandelins Reagenz • mit Marquis Reagenz Ammoniummolybdat in H2SO4 conc. Ammoniumvanadat inH2SO4 conc. Formaldehyd-Lsg. in H2SO4 conc.

9. Marquis-Reaktion am Beispiel Morphin + + + violett + H+ Ox.

10. Allgemeine Vorgehensweise Vorproben Identifizierung und Abtrennung des Trägers Ausschütteln in verschiedene Gruppen (Stas-Otto-Trennungsgang) Systematische Dünnschichtchromatographie (evtl. Detektion) Identifizierung der isolierten Arzneistoffe • Gruppenreaktionen • Spezielle Reaktionen • IR-Spektroskopie und andere analytische Methoden

11. Stas-Otto-Trennungsgang • Theorie: unterschiedliche Verteilung von Substanzen zwischen wässriger und organischer Phase Salzbildungsvorgänge unterschiedliche Löslichkeiten

12. Verteilungsvorgänge • Nach dem Nernstschen Verteilungsgesetz gilt allgemein: • hier:

13. Verteilungsbeispiel • Chloramphenicol wird bei pH 1 mit Ether ausgeschüttelt (Stas-Otto- Gruppe l) •  100 mg werden in 50 ml wässriger Phase vorgelegt •  Wie viel Arzneistoff liegt nach dreimaligem Ausschütteln mit je 50 ml TBME bzw. nach einmaligem Ausschütteln mit 150 ml TBME in der Etherphase vor? •  Löslichkeit: Wasser 1 g : 400 ml • Ether 1 g : 400 ml • Nach dreimaligem Ausschütteln: ■ 50 % liegen nach dem ersten Ausschütteln in der Etherphase vor, das sind 50 mg ■ nach dem zweiten Ausschütteln weitere 50 %, das sind 25 mg ■ nach dem dritten Ausschütteln nochmals 50 %, also 12.5 mg •  Nach dreimaligem Ausschütteln liegen also 87.5 mg • in der Etherphase vor!!

14. Verteilungsbeispiel •  Chloramphenicol wird bei pH 1 mit Ether ausgeschüttelt (Stas-Otto-Gruppe l) •  100 mg werden in 50 ml wässriger Phase vorgelegt •  Wie viel Arzneistoff liegt nach dreimaligem Ausschütteln mit je 50 ml TBME bzw. nach einmaligem Ausschütteln mit 150 ml TBME in der Etherphase vor? •  Löslichkeit: Wasser 1 g : 400 ml • Ether 1 g : 400 ml • Nach einmaligem Ausschütteln: ■ in beiden Phasen liegen gleiche Konzentrationen an Arzneistoff vor ■ in der Etherphase befindet sich daher die 3-fache Masse (3-faches Volumen!!) • Nach einmaligem Ausschütteln liegen also 75 mg • in der Etherphase vor!!

15. Stas-Otto-Trennungsgang • Vorbereitung der Probe: • gut durchmischen!! • 200 - 500 mg der Probe in ~ 30 ml dest. Wasser aufnehmen • Einstieg in den Trennungsgang durch Ansäuern auf pH 1 mit H2SO4

16. 200 – 500 mg Substanz in 30 ml dest. Wasser lösen, mit 3 N Schwefelsäure auf pH 1 ansäuern und mit Wasser auf 60 ml auffüllen Phase Ι:Saure Etherphase Säuren, Phenole, Ureide, Neutralstoffe 3 x 25 ml TBME ausschütteln Mit 8 %iger NaHCO3-Lsg. neutralisieren, mit 10 %iger Weinsäure-Lsg. auf pH 4-5 einstellen. 3 x mit 25 ml EE ausschütteln. Phase II: Saure Ethylacetatphase Schwache Basen, EE-lösliche Säuren, Phenole, Neutralstoffe 3 x 30 ml 0,5 N NaOH Phase III: Alkalische Etherphase Basen Wässrige Phase mit 3 N H2SO4 ansäuern und 3 x mit 50 ml TBME ausschütteln Mit 3 N NaOH auf pH > 10 alkalisieren, 3 x mit 25 ml TBME ausschütteln Phase IB Neutralstoffe Mit 3 N H2SO4 neutralisieren und mit 6N NH3 auf pH 9 bringen. 3 x mit 25 ml EE ausschütteln. Phase IV: Ammoniakalische Ethylacetatphase Phenolbasen, EE-lösliche Basen Phase IA Säuren, Phenole, Ureide Phase V: Wässrige Phase Nicht ausschüttelbaren Substanzen Säuren, KH, Aminosäuren, Quart. Ammoniumverb.

17. 200 – 500 mg Substanz in 30 ml dest. Wasser lösen, mit 3 N Schwefelsäure auf pH 1 ansäuern und mit Wasser auf 60 ml auffüllen Phase I: Saure Etherphase Säuren, Phenole, Ureide, Neutralstoffe 3 x mit 25 ml TBME ausschütteln Ibuprofen 3 x 30 ml 0,5 N NaOH + + H O O H O O hydrophiles Anion; wasserlöslich lipophile Säure; Wässrige Phase mit 3 N H2SO4 ansäuern und 3 x mit 50 ml TBME ausschütteln löslich in TBME Phase IB Neutralstoffe Paracetamol O O H N H N + + H O H O Phase IA Säuren, Phenole, Ureide hydrophiles Anion; wasserlöslich lipophil; löslich in TBME

18. 200 – 500 mg Substanz in 30 ml dest. Wasser lösen, mit 3 N Schwefelsäure auf pH 1 ansäuern und mit Wasser auf 60 ml auffüllen Mit 8 %iger NaHCO3-Lsg. neutralisieren, mit 10 %iger Weinsäure-Lsg. auf pH 4-5 einstellen. 3 x mit 25 ml EE ausschütteln. Phase II: Saure Ethylacetatphase Schwache Basen, EE-lösliche Säuren, Phenole, Neutralstoffe O H O Papaverin O O H O H H O H H O H M e O M e O wasserlöslich H O H O O H N + N M e O H O O H M e O O M e O M e O M e O M e wasserlöslich löslich in Ethylacetat

19. + H 200 – 500 mg Substanz in 30 ml dest. Wasser lösen, mit 3 N Schwefelsäure auf pH 1 ansäuern und mit Wasser auf 60 ml auffüllen Mit 3 N NaOH auf pH > 10 alkalisieren, und 3 x mit 25 ml TBME ausschütteln Phase III: Alkalische Etherphase Basen Methadon H2O + + + + N a O H Na

20. 200 – 500 mg Substanz in 30 ml dest. Wasser lösen, mit 3 N Schwefelsäure auf pH 1 ansäuern und mit Wasser auf 60 ml auffüllen Morphin Mit 3 N H2SO4 neutralisieren und mit 6 N NH3 auf pH 9 bringen. 3 x mit 25 ml EE ausschütteln Phase IV: Ammoniakalische Ethylacetatphase Phenolbasen, EE-lösliche Basen

21. 200 – 500 mg Substanz in 30 ml dest. Wasser lösen, mit 3 N Schwefelsäure auf pH 1 ansäuern und mit Wasser auf 60 ml auffüllen Ascorbinsäure Metamizol-Na Phase V: Wässrige Phase Nicht ausschüttelbare Säuren, Kohlenhydrate, Aminosäuren, Quart. Ammoniumverbindungen

22. Allgemeine Vorgehensweise Vorproben Identifizierung und Abtrennung des Trägers Ausschütteln in verschiedene Gruppen (Stas-Otto-Trennungsgang) Systematische Dünnschichtchromatographie (evtl. Detektion) Identifizierung der isolierten Arzneistoffe • Gruppenreaktionen • Spezielle Reaktionen • IR-Spektroskopie und andere analytische Methoden

23. Gruppenreaktionen • auf… □ Stickstoffverbindungen □Substanzen mit Carbonyl- oder Carboxylgruppen □ reduzierende Stoffe □ Sonstige

24. Stickstoffverbindungen Welche funktionelle Gruppen? □ a-Aminosäuren □ primäre aromatische Amine □ Pyridinderivate R

25. Nachweis von α-Aminosäuren Ninhydrin-Reaktion • Versetzen mit Ninhydrin-Lösung, danach Erhitzen bis zum Sieden

26. … am Beispiel Levodopa + H2O + - H2O - H2O • CO2 • - H2O

27. … am Beispiel Levodopa H2O + + H2O - H2O violett - H+

28. Nachweis primärer aromatischer Amine Diazo-Kupplungsreaktion eventuell nach vorheriger Hydrolyse z.B. Furosemid auch nach Reduktion z.B. Metronidazol Lösen der Substanz in HCl und versetzen mit Diazo-Reagenz l (Natriumnitrit) anschließend Eingießen dieser Lösung in Diazo-Reagenz ll (2-Naphtol in NaOH)

29. … am Beispiel Furosemid Reaktion nach vorheriger Hydrolyse mit 3-N HCl orange-rot + NaNO2 + 2-Naphtol HCl

30. Nachweis von Pyridinderivaten Zincke-König-Spaltung Verreiben der Substanz mit 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol und anschließendes Schmelzen Lösen der erkalteten Schmelze in ethanolischer KOH

31. + … am Beispiel Nicotinamid Cl- rot OH- OH-

32. Gruppenreaktionen • auf… • Stickstoffverbindungen □ Substanzen mit Carbonyl- oder Carboxylgruppen □ reduzierende Stoffe □ Sonstige

33. Carbonyl- oder Carboxylgruppen □ Carbonsäuren und –derivate □ abspaltbarer Formaldehyd

34. Nachweis von Carbonsäuren, Estern, Amiden und Anhydriden • Hydroxamsäurereaktion • Carbonsäuren nach Aktivierung mit Thionylchlorid • Derivate: • Reaktion mit Hydroxylamin-HCl-Lösung • und Eisen(lll)-chlorid-Lösung

35. … am Beispiel Ibuprofen Aktivierungder Carboxylfunktion mit SOCl2 rot +NH2OH +FeCl3

36. Nachweis von abspaltbarem Formaldehyd Chromotropsäurereaktion • Erhitzen der Substanz mit H2SO4 conc. und Chromotropsäure

37. 2 + Abspaltung von Formaldehyd … am Beispiel Metamizol-Na + + violett

38. Gruppenreaktionen • auf… • Stickstoffverbindungen • Substanzen mit Carbonyl- oder Carboxylgruppen □reduzierende Stoffe □ Sonstige

39. Nachweis reduzierender Verbindungen □ reduzierende Zucker □ olefinische Doppelbindungen

40. Nachweis von reduzierenden α-Hydroxycarbonyl-Verbindungen Fehling-Reaktion Positive Reaktion auch bei anderen starken Reduktionsmitteln (z.B. Ascorbinsäure) Mischen von Fehling-Reagenz l (CuSO4 x 5 H2O in Wasser) und Fehling-Reagenz ll (Kaliumnatriumtartrat / NaOH / H2O) Zusatz der reduzierenden Verbindung Erwärmen auf dem Wasserbad für bis zu 30 Minuten

41. … am Beispiel Ascorbinsäure Cu2+ als Kupfer(ll)sulfat schon bei Raumtemperatur Cu+ als Kupfer(l)oxid rotbraun

42. Prüfung auf olefinische Doppelbindungen Baeyersche Probe Reaktion mit KMnO4 in H2O / Na2CO3

43. … am Beispiel Amitryptilin rot-violett +7 + +5 + MnO3- + H2O farblos

44. Gruppenreaktionen • auf… • Stickstoffverbindungen • Substanzen mit Carbonyl- oder Carboxylgruppen • reduzierende Stoffe □Sonstige

45. Sonstige □Zimmermann-Reaktion Nachweis aktiver Methylengruppen • Reaktion mit 1,3-Dinitrobenzol in KOH □Kupplungsreaktion mit diazotierter Sulfanilsäure Lösen der Substanz in NaOH danach Zugabe einer 1:1-Mischung von Sulfanilsäure und 10%iger Natriumnitrit-Lösung

46. Zimmermann… am Beispiel Diazepam + - - H+ rot Meisenheimer- Salz -

47. Kupplungsreaktion … am Beispiel Paracetamol + + OH- - rot -

48. Gruppenreaktionen • auf… • Stickstoffverbindungen • Substanzen mit Carbonyl- oder Carboxylgruppen • reduzierende Stoffe • Sonstige

49. Spezielle Reaktionen □ Vitali-Morin-Reaktion Nitrierbare Aromaten □ Zwikker-Reaktion Barbitursäure Derivate, Hydantoine, Purine....... □ Murexid-Reaktion Purin Derivate (Xanthine), Barbitursäuren, Uracilen □ Chen-Kao-Reaktion 1,2-Aminoethanole □ Thalleiochin-Reaktion Chinolin-Ring mit einer Sauerstoff-Funktion in Pos. 6 □ Coralyn-Reaktion empfindlicher Nachweis für Papaverin

50. Zusammenfassung  schon Aussehen und Geruch können Hinweise auf Bestandteile eines Stoffgemisches geben  Trennung des Gemisches in verschiedene Gruppen durch einfache Salzbildungs- und verteilungsvorgänge möglich  nach erfolgter Trennung können durch Gruppenreaktionen gewisse Rückschlüsse auf die Struktur der Arzneistoffe gezogen werden • auch negative Nachweise geben dabei wichtige Informationen  spezielle Reaktionen dienen der näheren Identifizierung der Stoffe  endgültige Bestimmung der Identität erfolgt dann durch weitere analytische Methoden (DC, IR,…)