450 likes | 680 Views
KROMOSZÓMA SZINTŰ HIBÁK KIMUTATÁSA, MÓDSZEREK. Előadó: Dr. Kocsis Zsuzsanna Országos Kémiai Biztonsági Intézet Budapest, Nagyvárad tér 2. Helyszín: ELTE, 2010. 10. 20. Kompartmentalizáció Prokarióta sejtek Eukarióta sejtek. Kromatinalapszerkezet: nukleoszóma
E N D
KROMOSZÓMA SZINTŰ HIBÁK KIMUTATÁSA, MÓDSZEREK Előadó: Dr. Kocsis Zsuzsanna Országos Kémiai Biztonsági Intézet Budapest, Nagyvárad tér 2. Helyszín: ELTE, 2010. 10. 20.
Kompartmentalizáció Prokarióta sejtek Eukarióta sejtek Kromatinalapszerkezet: nukleoszóma * DNS kettős spirál és a hisztonok alkotják * Hisztonok: bázikus fehérjék (argininben és lizinben gazdag) * 5 osztályuk van: H1H1, H2A, H2B, H3 és H4 nukleoszomális hisztonok Hisztonkorong (oktamer): 8 hisztonmolekulából álló (2*4) 2 csavarulatban 146 bázispárnyi DNS tekeredik rá 2 korong között kb. 60 bp linkerrégió + H1 molekula
Kromoszóma morfológia Eukromatikusrégió: aktív géneket tartalmaz (génexpresszió, RNS szintézis) Heterokromatikusrégió: inaktív DNS szakaszok konstitutív heterokromatin (pl. centromer) fakultatív heteroktromatikus régió rövidkar centroméra hosszú kar testvérkromatidák
Kromoszóma territórium Egy adott kromoszóma a sejtmag egy adott régiójában található. Szigorú sejtmagi rend.
Humán lymphocyta kromoszóma preparátum Genom: a sejtmagban található összes genetikai információ. Kromoszóma: A genetikai információt tároló strukturális egység. Kromoszóma száma, morfológiája szervezettsége fajra jellemző és állandó. G-sávos normál női karyotípus
A sejtek kromoszómaszáma fajra jellemző, állandó érték. A testi sejtekben a homológ kromoszómák nagyságuk szerint párokba rendezhetők. A testi sejtekben a kromoszómakészlet kétszeres, azaz diploid. Az ember testi sejtjei 46 kromoszómát tartalmaznak. Az ivarsejtek kromoszómaszáma a testi sejtekének a fele, a petesejt és a hím ivarsejt haploid. Az emberek ivarsejtjeiben 23 kromoszóma található. A nők sejtjeiben két homológ X kromoszóma található, a korai embrionális fejlődés elején a sejtek egyik X kromoszómája inaktiválódik (Barr-test).
Öregedés, rák, stabil kromoszóma • Telomer: • - kromoszóma vége • - rövid TTAGGG szakasz több ezerszeres mennyiségben (20-25 ezer bázispár) • genetikai óra, telomer rövidülés öregedés • 2009 orvosi Nobel Díj • - minden osztódáskor 100 bp rövidülés a DNS polimeráz enzim • működéséből adódóan • - egészséges sejtekben a telomeraz inaktív és • - Az emberi sejt 50 osztódásra képes. • 50 osztódás után a sejt apoptózissal meghal. • Tumoros sejtekben a telomer szerepe: • a telomeráz enzim aktivitása magasabb • Azt gondolják, hogy a telomeráz enzim retrovírus eredetű. • Ivarsejtekben is!
MITOZIS * * * A mitózis gondoskodik a szülői és az utódsejt azonos kromoszómakészletéről. A sejtosztódás S fázisában a kromoszómák anyaga megkettőződik. A mitózis kromoszóma számtartó osztódás.
MEIOZIS A meiozis a kromoszóma-számfelező redukciós osztódása, ivarsejt képződésének módja. Az S fázisban 4C-re duplázódó DNS tartalom két egymást követő osztódás során a DNS tartalom C-re redukálódik. A petesejt és a hím ivarsejt haploid. Az emberek ivarsejtjeiben 23 kromoszóma található, tehát fele a testi sejtekénél.
X-kromoszóma inaktiváció A nőstény emlősök sejtjeiben Az egyik X-kromoszóma inaktiválódik (random módon), XfXv . Az inaktivált X kondenzálódik - Barr-testecske. Bizonyos sejtek utódai együtt maradnak (sejtklónok). A nőstény emlősök teste mozaikos, vagyis olyan sejtek klónjainak a keveréke, amelyekben hol egyik, hol a másik X aktív. Heterozigótákon detektálhatók lehetnek a foltok. Vörös/fekete tarka macskák esete
B IX. faktor A VIII. faktor Hemofilia Nemhez kötött recesszív megbetegedés
Vörös-zöld színtévesztés Férfiak Nők Vörös-zöld színtévesztés Nemhez kötött recesszív megbetegedés Vörös-zöld színtévesztés Fényérzékelő idegsejtek csapok (3 féle)
KROMOSZÓMA ABERRÁCIÓ TÍPUSAI: Strukturális kromoszóma aberráció: deléció inszerció transzlokáció Numerikus kromoszóma aberráció: poliploidia aneuploidia Genotoxikus anyagok a DNS-ben tárolt genetikai információt örökletes módon megváltoztatják.
Deléció kromoszóma szegmentek elvesztése Különböző humán betegségek delécióra vezethetőek vissza. A kis deléciók tolerálhatóak. A nagy deléciók nem tolerálhatóak, letalitáshoz vezetnek.
Cri du chat – macskasírás szindróma • Az ember esetében a genom kiegyensúlyozatlanság miatt a legkisebb deléciók is komoly abnormalitást okoznak. • A macskasírás szindróma estében az 5. kromoszóma rövid (p) karjának vége hiányzik. • Mikroencefáliával, holdszerű arccal és szellemi elmaradottsággal jár. 4 év alatti halál. • születéskori gyakoriság: 1/50,000
DUPLIKÁCIÓ DUPLIKÁCIÓ: Kromoszóma szegmensek megkettőződése. Jó példa a duplikációra a Drosophila Bar mutációja.
A gén duplikáció evolúciós szerepe Ha a gén fontos a szervezet számára nem változhat. De ha a génből több kópia van a képződő proteinek módosulhatnak és új funkciókat láthatnak el. Duplikációval keletkezett gén családok hasonló proteineket készítenek. Jó példa erre a globin gének, amelyekről α és β globin láncok szintetizálódnak, a hemoglobin szerkezeti alegységei.
A gén duplikáció lehetőséget ad, a mutációs változásoknak, a funkciók divergálásának • Az emberi hemoglobin gén duplikációs változások eredménye. Különböző életkorokban különböző alegységek alakítják ki a működő hemoglobin molekulát. 3 h. korig az embrionális Hemg. Szülésig a magzati Hemg. 20-30% Szülés után 2α 2ß.
Inverzió:Egy kromoszóma szakasz 180 fokos megfordulásának az eredménye. pericentrikus inverzió magába foglalja centromert paracentrikus inverzió a centromert nem érinti, csak a kromoszóma egyik v. másik karját Gén környezet, gén kapcsoltság, génátírás módosul.
TRANSZLOKÁCIÓ: intrakromoszómális transzlokáció: Egy kromoszóma szakasz áthelyeződése ugyanabba a kromoszómába. interkromoszómális transzlokáció: Nem homológ kromoszómák közötti transzlokáció. Transzlokáció során nincs genetikai anyag vesztés. A gének pozíciója azonban megváltozik.
Down szindróma: • 14 és 21-es kromoszóma közötti Robertson transzlokáció. • A 21-es krom. transzlokációja a 14-es krom.-ra eredményezi a familiáris Down syndromát.Örökölhető. • 21-es kromoszóma triszómia (Osztódási hiba) • Az anya életkorának előrehaladtával (40-45 év felett) az előfordulási gyakoriság exp. növekszik. Prenatális szűrés. • Születéskori gyakorisága nagy: • 1/500-1/700
Myeloid leukémiaA 9-es és a 22-es kromoszómák közötti transzlokáció eredménye a “Philadelphia kromoszóma”Az esetek 90%-ban krónikus myeloid leukemiát okoz.
Burkitt’s lymphomaAz esetek 90% esetén a 8-as és 14-es kromoszómák közötti transzlokáció következménye.Transzlokáció következtében kialakuló pozíció effektus hatására kialakuló onkogének, sejtosztódást, rák keletkezését okozhatják.
Alternatív toxikológiai in vitro vizsgálatok • Ajánlott teszt rendszerek: • Egysejtűeken végzett tesztek • Rovartesztek • in vitro sejtkultúrákon végzett tesztek • in vivo mutagenitási tesztek • long term karcinogenitási állatkísérletek • humán epidemiológiai vizsgálatok Genotoxikus és daganatkeltő hatások vizsgálata • előnyei: • in vitro körülmények között sejteken (élő állat alkalmazása nélkül ) • rövid idejű • olcsóbb • reprodukálható • nem használ élő állatot • Az esetleges hatás megállapításához több, különböző módszerrel végzett vizsgálat • egybehangzó eredményére van szükség.
Azonos szakmai szabályok GLP= Good Laboratory Practice (Helyes Laboratóriumi Gyakorlat) ISO= International Organization for Standardization (Nemzetközi Szabványügyi Szervezet) Vizsgálati irányelvek OECD= Organisation for Economical Cooperation and Development (Gazdasági es Fejlesztési Együttműködési Szervezet) Kromoszóma aberráció in vitro vizsgálata emlős sejteken OECD TG 473 vizsgálati irányelv szerint Célja: azon kémiai anyagok meghatározása, amelyek kromoszóma aberrációt okoznak emlős sejtekben.
A kromoszóma aberráció vizsgálat • Sejtek • Alkalmazható sejtvonalak jellemzői: • stabil permanens v. primer sejtkultúrák (pl. CHO, humán lymfocita) • jó növekedési képesség, rövid generációs idő, • kariotípus stabilitás, állandó krom. szám. • Kromoszómák alaki változatossága és stabilitása. • kínai hörcsög ovárium fibroblaszt sejt (CHO, Puck1957) • Tápfolyadékok, tenyésztési körülmények • Mesterséges tápfolyadékok elterjedése (Ham’s F12). • Sejtvonalak ellenőrzése: • Kariogram • Kromoszóma szám • Mycoplazma • Spontán kromoszóma aberráció gyakoriság • Történeti kontroll
Vizsgálati anyag előkészítése: • kémiai összetétel, szennyeződés, stabilitás • oldószer kiválasztása • hígítási sor készítése • stabilitás vizsgálat • archiválás • Elő-kísérlet: • citotoxicitási vizsgálat MTT-assay (mitokondriális szukcinát-dehidrogenáz enzim) • mitotikus index meghatározása • MI: A metafázisban lévő sejtek és a sejtpopuláció összes sejtjének aránya. • A sejtpopuláció proliferációjának a mértékét jellemzi. • Koncentráció • Legkevesebb három elemezhető koncentráció. • Citotoxikus anyag esetén: va. a festék-redukciót 50%-kal csökkenti. • Nem citotoxikus anyag esetén: va. 5 mg/ml v. 0,01M
Direkt-és indirekt-mutagén anyagok • Metabolikus aktiválás: • S9 alkalmazása • rágcsálók enziminducerrel (Aroclor 1254, v. fenobarbiturát és β-naftoflavon) kezelt májából előállított poszmitokondriális frakció (S9) • kofaktorokkal kiegészítve • (ADPH, glukóz-6-foszfát). • S9 végkoncentráció 1-10% közötti. • citokróm P450 enzim aktiválása. • Indirekt mutagének kimutatására alkalmas
Kontrollok: • Metabolikus aktiválás nélkül: MMS, EMS, Mitomycin-C • Metabolikus aktiválással: CP, Benz(a)pirén • Oldószer. tápfolyadék • Archiválás • Kezelési idők: • 4 óra +S9 • 4 óra -S9 KIÉRTÉKELÉS Negatív • pozitív 24 óra -S9 • ismétlés 48 óra -S9
Kolhicinezés: • Célja a metafázisos kromoszómák összegyűjtése • Őszi kikerics (Colchicum autumnale) hagymájából készült kivonat. Köszvény gyógyítására alkalmazták. A kolhicin sejtosztódás gátló, a mitózis metafázisában. • Normál esetben a sejtek 2-5%-a osztódik, néhány órás kolhicinezés összegyűjti a sejteket a metafázisban, akár 40-50 %-uk is blokkolt metafázisban található. • A kolhicin a magorsó mikrotubulusaihoz kötődik.
Kromoszóma preparátum • Fénymikroszkópos értékelés • kromatid típusú aberrációk:kromoszóma típusú aberrációk: • deléció deléció • exchange exchange
Humán limfocita. Kezeletlen kontroll. Felvétel: OKBI. MSBO. 2000.
B.19. IN VITRO EMLŐSSEJT TESTVÉR – KROMATID KICSERÉLŐDÉS (SISTER CHROMATID EXCHANGE , SCE) VIZSGÁLAT OECD TG 479 A testi sejtek kromoszómáiban a testvér-kromatidák közötti kicserélődés. reciprok DNS csere. Láthatóvá tehető, ha két sejtcikluson át bróm-dezoxi-uridinnel (timidin-analóg) jelöljük. Hoechst festés, majd UV kezelés, klasszikus Giemsa festés. Az SCE nem kromoszómaaberráció (Ctr. SCE 5). Az SCE már olyan kis vegyi mutagén-karcinogén expozíció kiváltja, amelyik még nem okoz krom. aberrációt. Alkalmazása primer prevencióban.
Bloom syndroma • Örökletes betegség, családi halmozódás 15q26.1, a BLM gén mutációja. • Fokozott sister chromatid exchange (SCE) és spontán kromoszóma törékenység. • DNS repair enzimek károsodása • Jelentős mutagén túlérzékenység. normál sejt Bloom syndromás beteg sejt
Bloom szindróma A KROMOSZÓMA INSTABILITÁST JELLEMZI a/ a kromoszóma törések nagy száma b/ a testvér kromatida kicserélődések nagy gyakorisága c/ a magasabb daganatképződési kockázat d/ DNS reparációs hibák
B. 18. Nem-tervezett DNS-szintézis (UDS) in vitro vizsgálata emlős májsejteken OECD TG 482 Primer hepatocita sejtkultúra. Felvétel: OKBI. MSBO. 2000.
In vitro mikronukleusz teszt Validált (OECD Guideline 487) Kromoszóma mutációk kimutatására alkalmas Kb 80% egyezés a kromoszóma aberráció teszttel, érzékenyebb, olcsóbb, gyorsabb Mikronukleusz: a sejtmagnál kisebb méretű, membránhatárolt DNS darabok, amelyek a citoplazmában jelennek meg a sejtosztódás zavara esetén