UV-VIS MOLEKULASPEKTROSZKÓPIAI MÓDSZEREK

1. UV-VIS MOLEKULASPEKTROSZKÓPIAI MÓDSZEREK .

2. 1. Elektronok gerjesztési lehetőségei a molekulákbanMolekulák létrejöttekor az atompályák kombinációjának következtében a molekulapályák két sorozatához (kötő ill. lazító) jutunk. Ha a molekula elektromágneses sugárzást nyel el az alacsonyabb energiájú kötőpályán lévő elektron a magasabb energiájú lazítópályára gerjesztődik. 1. ábra. A formaldehid (H2C=O ) molekulapályái ill. elvileg lehetséges elektronátmenetei

3. 1.1. A lehetséges elektronátmenetek jellemzői σ → σ * átmenet - egyszeres kötésben részt vevő elektron gerjesztésekor jellemző, - az átmenet gerjesztésére nagy energiájú, távoli ultraibolya sugarak alkalmasak, - általában nem vizsgálhatóak, mert a gerjesztéshez szükséges sugárzás hullámhossza kisebb, mint 200 nm (itt alevegő oxigénje is gerjesztődik ill. a molekula széteshet) π → π * átmenet - a telítetlen kettős és hármas kötéseket tartalmazó vegyületekre jellemző, - a gerjesztéshez kisebb energia szükséges, mint az egyszeres kötéseknél, így a közeli UV-ben, esetenként a látható tartományban gerjeszthető. n → σ * és n → π * átmenetek - nem kötő, magános elektronpárral rendelkező heteroatomot (O, N, S, halogének) tartalmazó vegyületekben lehetségesek: - n → π * átmenet esetében ez az atom kettős kötésben, illetve heteroaromás gyűrűben található (C=O, C=N, piridin), - n → σ * átmenet esetében egyes kötéssel kapcsolódik a molekulához (alkoholok, éterek, alkil/aril-halogenidek). •  •  • . • 3.1.2. Az UV-VIS-spektrumok felvételének körülm

4. 1.2. Kiválasztási szabályok Megszabják, hogy mikor megengedett vagy tiltott két molekulapálya között az elektronátmenet: • A különböző spin multiplicitású állapotok (szingulett → triplett) között az átmenet tiltott, azonosak között megengedett. • Elektronátmenet olyan pályára megengedett, melynek ugyanolyan szimmetriája van, mint az alapállapot szimmetriája és amelynek több csomósíkja van, mint az alapállapot elektronpályájának. • Ortogonális, azaz egymásra merőleges pályák közti átmenetek tiltottak (pl. C=O csoport n → π * átmenete). Tiltott elektronátmenethez tarozó sávok vagy meg sem jelennek a spektrumban vagy nagyon kis intenzitásúak ( ε értéke nagyon kicsi) . Pl. a C=O csoport acetaldehidben (gőz állapotban): n → π * átmenet: λmax =298 nm ε= 12.5 dm3mol-1 cm-1 π → π * átmenet: λmax =182 nm ε= 10000 dm3mol-1 cm-1

5. 2. ábra:A karbonil csoport (>C=O) molekulapályái és elelektronátmenetei

6. 1.3. Az abszorpció hullámhosszát befolyásoló tényezők Az elektron gerjesztéséhez szükséges energiát (a gerjesztő foton hullámhosszát, vagyis az elnyelési sáv helyét a spektrumban ) a kémiai kötés erőssége határozza meg, amely ily módon jellemző a kötést létrehozó atomokra. Ez a minőségi analízis alapja. Kromofórok: az abszorpciót okozó atomcsoportok. Auxokróm csoportok: maguk nem abszorbeálnak, de a kromofórokkal kölcsönhatásba lépve (molekulapályák közötti konjugáció) megváltoztatják az abszorpciós sáv a. hullámhosszát: hullámhossz növekedése: batokróm eltolódás, hullámhossz csökkenése: hipszokróm eltolódás, b. intenzitását: abszorbancia növekedése: hiperkróm eltolódás, abszorbancia csökkenése: hipokróm eltolódás.

7. 1.4. A molekulapályák közötti konjugáció A konjugáció elektroneltolódással járó effektus, amely π – π, n – πill.σ - π pályák között jöhet létre: π – π konjugáció: a π pályák közötti kölcsönhatás eredményeképpen policentrikus molekulapályák jönnek létre, aminek következtében kis energiájú π – π* átmenetekre van lehetőség, így a konjugált rendszer a nagyobb hullámhosszakon abszorbeál. (batokróm hatás, lásd. 3. ábra). n – π konjugáció: kromofór és auxokróm csoport között létrejövő kölcsönhatás, amikor a heteroatom (pl. halogén ) magános elektronpárja delokalizálódik a π -rendszeren, aminek következménye szintén a nagyobb hullámhosszakon történő abszorpció (batokróm hatás , lásd 4. ábra). σ - π konjugáció (hiperkonjugáció): a σ kötés elektronpárja kölcsönhatásba lép a π renndszerrel, az abszorpció a magasabb hullámhosszak felé tolódik el (batokróm hatás, pl. metil-csoport kölcsönhatása az aromás π renszerrel a toluolban)

8. 3. ábra. π – π konjugáció

9. 4. ábra. n – π konjugáció

10. 1.4. A molekulaspektrumok sávos jellege Atomok belső energiájának megváltozása: ΔEatom = ΔEelektron = hν Következmény: vonalas (0.005-0.02 nm) spektrum. Molekulák belső energiájának megváltozása: ΔEmolekula = ΔEelektron + ΔErezgési + ΔEforgási = hν Vagyis: egy foton abszorpciója egyidejűleg okozhatja mindhárom állapot megváltozását! Következmény: sávos (10-50 nm) spektrum. ΔEelektron ~10·ΔErezgési ~10· ΔEforgási

11. 1. Ábra. Molekulák gerjesztési lehetőségei (az elektron-rezgési-forgási spektrum)

12. 2. ábra. Kétatomos molekula potenciális energiája az atomtávolság fv.nyében - a potenciálgörbék minimumai közötti távolság az elektron gerjesztéséhez szükséges energia - gerjesztett állapotban nagyobb a magtávoság és kisebb a disszociációs energia, ezért a gerj. állapotok görbéi jobbra tolódnak el és laposabbak.

13. 3. ábra. Az akridon sávos spektruma

14. 2. Molekulaspektroszkópiai módszerek csoportosítása

15. 2. Mennyiségi analízis 2.1. Lambert-Beer törvény: egy adott λ= áll. hullámhosszon, híg oldatokban: • A = -lg T = ε·l·c • T = It/I0 ahol A ( - ) abszorbancia T ( - , vagy %) transzmittancia It , I0 az áteresztett (transzmittált) ill. a beeső fény intenzitása c (mol/dm3) koncentráció l (cm) optikai úthossz ε (dm3·mol-1·cm-1) moláris abszorpciós koefficiens Egy adott vegyületnél minden abszorpciós csúcshoz más hullámhossz, ezért más ε tartozik, vagyis minden hullámhosszra más-más LB törvény írható fel!

16. 3. Mennyiségi analízis Az abszorbancia additív: ha egy oldatban az adott hullámhosszon több komponens is elnyel a mért abszorbancia az egyes komponensek abszorbanciáinak összege: A = Σ Ai = A1 + A2 +…+An = ε1·l·c1 + ε2·l·c2 +….+ εn·l·cn Kétkomponensű elegy összetételének meghatározása: Két olyan hullámhosszon (λ1, λ2) mérünk, ahol mindkét komponens elnyel: 1. Először meghatározzuk a tiszta komponensek moláris abszorpciós koefficienseit a két hullámhosszon (ε11 , ε12, ε11 , ε12) , 2. Megmérjük az elegy abszorbanciáját a két hullámhosszon (A1, A2) 3. Megoldjuk a 2 db két ismeretlenes (c1, c2)egyenletet: A1 = = ε11·l·c1 + ε12·l·c2 A2 = = ε21·l·c1 + ε22·l·c2

17. 2. Mennyiségi analízis 2.2. Eltérések a Lambert-Beer-törénytől 2.2.1. Tömény oldatokban (c > 10-2 M) ε nem független a koncentrációtól, mivel az oldat törésmutatója a koncentráció növelésével nő. 10-2M-nál nagyobb koncentrációk esetén: ε* = ε·n / (n2+2)2 ahol n az oldat törésmutatója 2.2.1. Híg oldatokban (c < 10-2 M) 2.2.1. 1. Kémiai okokra visszavezethető eltérések A mérendő oldatban disszociáció, asszociáció, szolvatáció, komplexképződés játszódhat le, aminek következtében az abszorbeáló részecskék koncentrációja megváltozik. A jelenség felhasználható egyensúlyi állandó meghatározásához. Pl. így meghatározható indikátorok pKi értéke: az indikátorok két formája (nem disszociált molekula ill. anion) egymástól eltérő színű, mivel más-más szerkezetűek →más-más hullámhosszon abszorbeálnak.

18. Egyensúlyi állandó meghatározása Az indikátor (mint gyenge sav) disszociációs egyensúlya: HIn ↔ H+ + In- Egy λ=áll. hullámhosszon, ahol mindkét forma elnyel valamilyen mértékben, három pH értéknél mérünk: • pH1 = 0 (erősen savas közeg): itt az indikátor (gyenge sav) nem disszociál, csak HIn formában van jelen, melynek elnyelése: AHIn = εHIn·l·c Ebből ismert c konc. oldat esetén εHInmeghatározható. 2. pH2 = 14 (erősen lúgos közeg): itt az indikátor (gyenge sav) teljesen disszociál, csak In- formában van jelen, melynek elnyelése: AIn = εIn·l·c 3. pH3 ~ pKikörnyékén: az indikátor részlegesen disszociál, mindkét forma jelen van, melyek elnyelése: A = AHIn+AIn = εHIn·l·cHIn + εIn·l·cIn mivel: c = cHIn+cIn, a két egyenletből cHInés cInszámítható. Az egyensúlyi állandó: Ki = (H+) · (In- ) / (HIn) = 10-pH3 · cIn / cHIn

19. Izobesztikus pontHa a kémiai egyensúly mindkét partnere (pl. HIn és In-) abszorbeálja a sugárzást, és található olyan λ1, ahol εHIn> εIn, valamint olyan λ2, ahol εHIn< εIn, akkor a görbék folytonossága miatt lennie kell legalább egy olyan hullámhossznak, ahol εHIn= εIn , azaz a görbék metszik egymást.Ezt a metszéspontot izobesztikus pontnak nevezzük. Az izobesztikus pont hullámhosszán mérve meghatározható a vegyület összkoncentrációja.

20. 2.2.1. 1. Fizikai okokra visszavezethető eltérések • A besugárzó fény (I0) nem szigorúan monokromatikus (Δλ szélességű) Keskeny éles csúcsok esetén ez jelentős hibát okozhat, ezért célszerű az elnyelési sáv maximumához tartozó hullámhosszon mérni. • A hőmérséklet hatása Alacsonyabb hőmérsékleten az abszorpciós sáv szélessége csökken ( a csúcs élesedik), mivel csökken a gerjesztett forgási és rezgési nívók betöltöttsége. A sávmaximum helye a kisebb hullámhosszak felé tolódik el. Az abszorbancia hőmérsékletfüggése 1-1.5 %/C0 • A mérés során változik a fényforrás intenzitása , vagy a jelfeldolgozó erősítése Melegszik a lámpa, ezért jobban emittál. A hiba kiküszöbölhető két fényutas készülék alkalmazásával. • Változik a detektor érzékenysége (az idő függvényében) Ezért jobban preferált a két sugárutas egy detektoros készülék.

21. 3. UV-VIS spektrofotométerek A készülékek fő egységei: • Fényforrás: folytonos emissziós spektrumot szolgáltató fényforrás (lámpa) UV-tartomány: deutérium lámpa Látható tartomány (VIS): wolfram-halogén lámpa 2. Fényfelbontó egység: optikai szűrő (üvegszűrő vagy interferencia szűrő) monokromátor (prizmás, optikai rácsos) 3. Mintatartó: küvetta (folyadék mintákhoz) speciális gázküvetta (gáz halmazállapotú mintákhoz) speciális mintatartó szilárd mintákhoz (fóliák, fényvédő krémek, UV-szűrő üvegek vizsgálatához) A mintatartók anyaga az UV-tartományban kvarcüveg, a látható tartományban kvarcüveg, normál üveg ill. műanyag (plexi).

22. 4. ábra.Különböző folyadéktartó küvetták

23. UV-VIS spektrofotométerek 4. Detektor: fotocella fotoelektron sokszorozó fotodióda CCD 5. Jelfeldolgozó, kijelző egység: analóg (mutatós) műszer PC (megfelelő adatfeldolgozó szoftverrel) Spektrofotométer típusok: egy fényutas két fényutas – egy detektoros - két detektoros

24. 5. ábra. Spektrofotométer típusok

25. 6.a. ábra Kétsugárutas, egy detektoros spektrofotométer

26. 6.b. ábra. Diódasoros spektrofotométer

27. 4. Alkalmazások 4.1. Minőségi analízis: funkciós csoportok felismerése A módszer önállóan nem használható szerves vegyületek szerkezetének meghatározására (széles egymást átfedő sávokat tartalmazó spektrum →kevés információ) , de más módszerekkel (IR, NMR, MS) együtt alkalmazva hasznos információkat szolgáltat. 4.2. Egyensúlyi állandók meghatározása: Kromofór csoportot tartalmazó gyenge savak, bázisok (pl. indikátorok) disszociációs állandóinak meghatározása. 4.3. Titrálási folyamatok végpontjelzése: Ha titrálandó vegyület, a reagens vagy a keletkező termék közül valamelyik abszorbeál a végpont fotometriásan jelezhető. Akkor is működik, ha az oldat színes vagy nincs indikátor, vagy az átcsapás rosszul észlelhető (lásd ábra). 4.4. HPLC készülékek detektoraként diódasoros detektor → háromdimenziós spektrum 4.5. Fémionok mennyiségi meghatározása

28. 7. ábra. Fotometriás titrálási görbék

29. 4.5. Fémionok spektrofotometriás meghatározása A meghatározás alapja: A fémionok szerves ligandumokkal színes komplexeket képeznek. A legtöbb szervetlen fémvegyület színtelen, viszont a komplexképző ligandum hatására a fémionok ötszörösen degenerált d-atompályái felhasadnak és így létrejön egy, a látható fény fotonjával gerjeszthető d-d átmenet (lásd ábra). A komplexképzés szelektív, a keletkező komplex stabil és intenzíven abszorbeál (nagy abszorpciós koefficiens), így nagyon érzékeny módszerek ismertek, akár 10-5 M koncentrációjú oldatok is mérhetők. A kationokhoz hasonlóan számos anion (klorid, nitrit, nitrát, foszfát) is meghatározható megfelelő szerves reagensekkel. Pl. Fe2+: 1-10-fenantrolin, pH = 4, λ = 510 nm Fe3+: NH4SCN, pH = 1, λ = 490 nm szulfoszalicilsav pH = 1-4, λ = 500 nm

30. 8. ábra. Átmeneti fémek d-elektronpályáinak felhasadása a ligandum hatására

31. FLUORIMETRIÁS MÓDSZEREK .

32. 1. Alapjelenségek, definíciók Lumineszcencia: Az anyag a különböző módon felvett gerjesztési energiát elektromágneses sugárzás formájában (foton kibocsájtásával) adja le. Alumineszcencia fajtái: • kemilumineszcencia: kémiai reakcióban gerjesztett állapotú molekula (termék, közti termék) keletkezik. Ha biokémiai (enzim katalizálta) reakcióban keletkezik: biolumineszcencia. • Fotolumineszcencia: a molekula gerjesztése elektromágnenses sugárzással történik • fluoreszcencia: a gerjesztés ill. a relaxáció alatt a gerjesztett elektron spin állapota nem változik meg, ezért a jelenség gyors. • foszforeszcencia: a gerjesztés ill. a relaxáció közben a gerjesztett elektron spin állapota megváltozik . Mivel az ilyen átmenet tiltott(ezért kis valószínűségű), a gerjesztés és a relaxáció között viszonylag sok idő telik el.

33. 1. ábra. Biolumineszcencia (szentjánosbogár)

34. 2. Fluoreszcencia ill. foszforeszcencia létrejötte • fotonabszorpció: az elektron a gerjesztett állapot egy magasabb rezgési szintjére kerül 1.a. rezgési relaxáció: a molekula alacsonyabb rezgési szintre kerül 2. fluoreszcencia: az elektron a gerjesztett állapot legalsó rezgési szintjéről fotonemisszióval az alapállapot valamelyik rezgési szintjére kerül. Frank-Condon-elv: a foton emissziója mindig a gerjesztett állapot legalsó rezgési szintjéről történik. 3. külső átalakulás (quenching, kioltás): fotonemisszió nélküli (pl. ütközéses) relaxáció 4. intercrossing system(belső átrendeződés): az elektron spinje átfordul, a molekula szingulett állapotból triplett állapotba kerül 4.a.rezgési relaxáció: a molekula alacsonyabb rezgési szintre kerül 5. foszforeszcencia: az elektron újabb spinátfordulás után fotonemisszióval az alapállapot valamelyik rezgési szintjére kerül. 6. külső átalakulás (quenching, kioltás): fotonemisszió nélküli (pl. ütközéses) relaxáció

35. 2. ábra. Molekulák energialeadásának módjai

36. 3. ábra. Különböző spinállapotok

37. 2. Fluoreszcencia és a molekulaszerkezet 2.1. Mely molekulák fluoreszkálnak? • A delokalizált π-kötéseket tartalmazó aromás vegyületek, többszörösen konjugált kettős kötéseket tartalmazó vegyületek (pl. poliének). 2.1. Milyen hatások befolyásolják a fluoreszcenciát? • Minél merevebb egy molekula, annál inkább hajlamos a fluoreszcenciára, mivel a merevség (és a nagy tömeg) csökkenti a rezgésre való hajlamot , így a gerjesztési energiát inkább kisugározza. • A molekulában a kromofórhoz kapcsolódó szubsztituensek befolyásolják a fluoreszcencia erősségét: - Az elektronküldő csoportok (-OH, -NH2, -O-alkil, -N-alkil) növelik • Az elektronvonzó csoportok (-COOH, -NHCOCH3) csökkentik, vagy teljesen kioltják (-NO, -NO2, halogének). • Ha a szubsztituens savas vagy bázikus jellegű a flureszcencia pH-függő • A hőmérséklet csökkenti a fluoreszcenciát, mert az oldatban nő a molekulák kinetikus energiája (mozgékonysága), így az ütközéses kioltás valószínűsége. • Az erős van der Waals kölcsönhatásra képes oldószerek növelik az ütközéses kapcsolat idejét, így csökkentik a fluoreszcenciát.

38. 4. ábra. A molekulaszerkezet hatása a fluoreszcenciára Fluorén: merev szerkezet ( a metil csoport miatt) nagy hajlandóság a fluoreszcenciára kvantumhatásfok (Φk) = 1 Bifenil: rugalmas szerkezet, a két fenil csoport külön-külön könnyen rezgésbe hozható, a molekula alig fluoreszkál kvantumhatásfok (Φk) = 0.2

39. 5. ábra. Fluoreszkáló anyagok:1. Aminosavak fluoreszcencia spektruma2. Fluoreszcein molekula (festék, indikátor) 3. Fluoreszkáló fehérjemolekula (GFP, Green Fluorescent Protein), 2008: kémiai Nobel díj Gerjesztés: 396 nm UV, 475 nm kék Emisszió: 508 nm zöld Fluorofór csop.: szerin-tirozin-glicin

40. 2.3. A fluoreszcenciaspektrumA fluoreszcencia spektrum tükörképe az abszorpciós spektrumnak, csak a fluoreszcencia spektrum sávjai a nagyobb hullámhosszak felé eltolódnak.6. ábra. Akridon flureszcenciaspektruma

41. 3. Mennyiségi analízis A fotolumineszcenciás (fluoreszcenciás, foszforeszcenciás) módszer mérési elrendezése és analitikai függvénye

42. 4. A fluoreszcencia alkalmazásai 4.1. Az abszorpciós és fluoreszcens módszer összehasonlítása - A fluoreszcencia intenzitása (IF) növelhető a megvilágító fényforrás intenzitásának (I0)növelésével, így nő a mérés érzékenysége, sokkal kisebb kimutatási határok (akár 10-8 M) érhetők el. - Mivel kevés anyag fluoreszkál számottevő mértékben, ezért szelektívebb, mint az abszorpciós módszer. - Hátránya, hogy nem robosztus, a fluoreszcencia mérések nagyon érzékenyek a pH-ra, hőmérsékletre, oldószerre, kioltó anyagok jelenlétére. 4.2. Gyakorlati alkalmazási lehetőségek • fluoreszkáló vegyületek mérése • nem fluoreszkáló de kémiai reakcióval (származékképzés) azzá tehető vegyületek meghatározása (kromatográfia, immunoassay) • nem fluoreszkáló, de a fluoreszcenciát kioltó anyagok meghatározása • alkalmazás HPLC detektorokként