Distribución y concordancia del genotipo y fenotipo de la N-Acetiltransferasa

1. Distribución y concordancia del genotipo y fenotipo de la N-Acetiltransferasa durante la maduración en niños argentinos.

2. Introducción: • La isoniacida es metabolizada por la geneticamente polimorfa NAT2. • Los diferentes alelos están relacionados con incremento o disminución de la capacidad de acetilación y en algunos casos disminución de la eficacia y toxicidad of isoniazida. • Este polimorfismo potencialmente es responsable, en un número sustancial de individuos, de un incremento del riesgo de varios efectos adversos por drogas, incluyendo hemólisis por sulfasalazina, neuropatía inducida por hidrazina o arilamina, lupus eritematoso asociado a la terapia con procainamida e isoniazida y sindrome de Stevens-Johnson (necrolisis epidérmica tóxica) asociada a la administración de sulfonamidas. • Existen resultados experimentales en otras poblaciones pediátricas sobre la influencia del desarrollo en la actividad NAT2, sin embargo en la Argentina no se ha determinado aún la distribución del tipo acetildador de acuerdo a la edad, por lo que las dosis se calculan extrapolando la información proveniente de otras poblaciones, lo que no garantiza la eficiencia y seguridad del tratamiento en nuestros niños.

3. Objetivos Generales: • Determinar la influencia del desarrollo pediátrico en el fenotipo acetilador • Determinar las consecuencias de la maduración del fenotipo acetilador en la farmacocinética de la isoniacida en la población pediátrica argentina. • Objetivos Específicos: • Determinar las características demográficas de la población. • Determinar el genotipo de NAT2 • Determinar el fenotipo de NAT2 por análisis del Coeficiente metabólico molar acetilisoniazida/isoniazida. • Correlacionar el Fenotipo con la Edad, analizando la frecuencia de acetiladores rápidos, intermedios y lentos por grupos etáreos de características similares. • Correlacionar el fenotipo con las concentraciones plasmáticas de isoniacida • Valorar las concentraciones de Isoniacida y sus implicancias en la terapéutica. • Determinar si existen subgrupos poblacionales con mayor o menor riesgo de toxicidad /falta de eficacia del tratamiento.

4. Metodología: • Ambito de estudio: Hospital General de Agudos Donación Francisco J Santojanni. • Tipo de estudio: Estudio piloto abierto, no randomizado. • - Tipo de Estrategia: Cuantitativa • - Según los Objetivos: Analítico Observacional • - Según la intervención del investigador: Observacional • - Según la Temporalidad: Transversal. • Población: Universo o población objetivo: niños argentinos de 0 a 17 años. • Población accesible: • pacientes de 0 a 17 años que concurran al Hospital Santojanni y reciban tratamiento con isoniacida, por quimioprofilaxis o por tratamiento de TBC. • Tamaño muestral: 50 individuos.

5. Metodología: • CRITERIOS DE INCLUSIÓN • Edad de 0 a 17 años de edad • Deban recibir isoniazida como quimioprofilaxis o terapéutica específica de TBC. • Hemodinámicamente estables • Función hepática normal determinada por AST, ALT y bilirrubina • Función renal normal definida por un valor de creatinina dentro de los límites normales por edad y /o con un valor de creatinina que sea normal para ese paciente individual basado en su historia clínica • Test de embarazo negativo en pacientes de sexo femenino en edad reproductiva. • Firma del Consentimiento Informado: • Aprobado por el Comité de Etica del Hospital • ICH E6 (13) e ICH E11(14) • CRITERIOS DE EXCLUSIÓN • Historia de alergia a la isoniazida

6. Metodología: • RECLUTAMIENTO DE PACIENTE • Los profesionales encargados del seguimiento de los casos de TBC recibieron información detallada para poder: • Recolectar datos de los pacientes potencialmente incluíbles en el estudio. • Citarlos para asistir al “Hospital de Día Pediátrico” en días y horarios adecuados para ser entrevistados por el investigador a fin de brindar la información del consentimiento informado, y obtener el mismo. • En caso de aceptar se programará la extracción del laboratorio control 3 horas posteriores a la ingesta de la isoniacida, para con la misma venopuntura extraer el volúmen de sangre adicional necesario para el análisis de genotipo y fenotipo. • - Durante la consulta el investigador obtendrá siguientes datos: • Datos Identificatorios del sujeto. • Características antropométricas y epidemiológicas. • Características del Tratamiento.

7. Metodología: • EXTRACCIÓN Y MANEJO DE LAS MUESTRAS: • Los individuos recibirán una dosis oral de 10 mg/kg de isoniazida. • Tres horas después de la dosis se extraerá 1 ml de sangre que se separarán en dos tubos: • Uno conteniendo 0,2 ml con EDTA (Genotificación) • y otro heparinizado con 1 ml para fenotipificación de la NAT2. • Ambas muestras serán transportadas en envases conteniendo hielo seco a –20 ºC al Centro de Farmacocinética para su procesamiento inicial y almacenamiento a –80°C.

8. Metodología: • PROCEDIMIENTOS Y MÉTODOS ANALÍTICOS • GENOTIPIFICACIÓN DE NAT-2: • AISLAMIENTO DE ADN GENÓMICO • DETERMINACIÓN DE GENOTIPO DE NAT2: método de Blum M • dos PCRs de 30 ciclos cada una, y el empleo de 2 pares de primers para cada muestra • Reacción 1: amplificará un fragmento de 1165-bp, • P1: CACGACGTTGTAAAACGA CAGGGGATCATGGACATTGAA • P2: TCTAGCATGAATCACTCTGC. • La reacción 2: amplificará un fragmento de 652-bp empleando: • P3: CACGACGTTGTAAA y P4: GGTTTGGGCACGAGATTTCT. • ANÁLISIS DE RESTRICCIÓN • Enzimas MspI/HpaII, KpnI, y BamHI detectan la pérdida de sitios de restricción en los nucleótidos nt 191, 481 y 857, respectivamente. • El producto de la reacción 2 será digerido con TaqI para detectar pérdida del sitio nt 590. • Los productos serán analizados en geles de agarosa al 1%, salvo los digestos de TaqI, (geles al 2%). Alelo variante: sustitución en nucleótidos: 191, 282, 481, 590, 803 o 857. • Los individuos con dos alelos sustituidos serán clasificados como acetiladores lentos. Los heterocigotas con un alelo de tipo salvaje (wild-type) y una copia de un alelo variante, o con dos alelos de tipo salvaje, serán clasificados como acetiladores rápidos.

9. Metodología: • PROCEDIMIENTOS Y MÉTODOS ANALÍTICOS • FENOTIFICACIÓN DE NAT-2: • Las concentraciones de isoniazida y acetilisoniazida se determinarán mediante HPLC (13) • Cociente metabólico molar acetilisoniazida/isoniazida (MR): El MR será utilizado para separar la población en: • acetiladores lentos (MR<0,48), • acetiladores rápidos (MR>0,77) y • acetiladores intermedios (0,48<MR<0.,77)16. • Este parámetro será tomado como prueba de la actividad de la N-acetiltransferasa.

10. Metodología: • Plan de análisis de los resultados. • Las frecuencias de alelos y fenotipos se presentarán como porcentajes. La distribución del MR será estudiado por un histograma con los valores logarítmicos de MR, análisis probítico, log-lineal y pruebas normales. • La muestra estudiada se categorizará en grupos: • Recien nacidos de 0 a 27 días, • Infantes de 28 días a 23 meses, • Niños de 2 a 4 años, • Niños de 4 a 6 años, • Niños de 7 a 17 años, • La correlación entre MR y edad (coeficiente de correlación RHO) se evaluará con el Test de Spearman. • La proporción de frecuencias acumulativas para acetiladores rápidos e intermedios será definida como la frecuencia de las mismas en niños por debajo de una determinada edad y se calculará por cociente entre el número de acetiladores rápidos e intermedios y el total de niños estudiados dentro del mismo grupo de edad.

11. Resultados

12. Resultados Obtenidos: La técnica analítica y reactivos: Se han preparado por síntesis orgánica los patrones de los posibles productos metabólicos que deben ser utilizados para la determinación tanto cuali como cuantitativa de isoniazida y sus metabolitos en sangre periférica de individuos que reciben tratamiento con dicho fármaco. Una modificación de la técnica descripta por Fox y Gibas, empleando síntesis asistida por microondas, permitió obtener en minutos el N-acetil-derivado como producto único. Corroboración de la estabilidad de las muestras Tiempo y forma de conservación.

13. Resultados Obtenidos: Disponibilidad de pacientes: Se mantiene un registro de pacientes en tratamiento con isoniacida y se han realizado charlas con los profesionales encargados de su cuidado verificando la factibilidad de su inclusión en el estudio. Los niños que se han juzgado pueden participar son contactados periódicamente por el servicio de infectología pediátrica, y controlados mensualmente con laboratorio. Número de sujetos incluídos actualmente: 38

14. Resultados Obtenidos: Características de los pacientes incluídos:

15. Resultados Obtenidos: Características de los pacientes incluídos:

16. Resultados Obtenidos: Características de los pacientes incluídos:

17. Resultados Obtenidos: Características de los pacientes incluídos: Fenotipo Acetilador: 11 muestras analizadas

18. Actividades pendientes: • Inclusión de 12 pacientes adicionales • Análisis del fenotipo de las muestras restantes • Genotipificación de las muestras ya obtenidas y almacenadas • Análisis de correlación entre genotipo y fenotipo

19. Muchas Gracias