Rasterionenleitf higkeits-mikroskopie

1. Rasterionenleitf�higkeits-mikroskopie Scanning Ion-Conductance Microscopy (SICM) 1 28.08.2012

2. Gliederung Einf�hrung Theorie Betriebsmodi Anwendungen Ausblick 2 28.08.2012

3. Einf�hrung: Aufbau 3 28.08.2012 Beschreibung des Aufbaus mit Erkl�rung der grunds�tzlichen Funktionsweise Erkl�rung des Modulationspiezos Beschreibung des Aufbaus mit Erkl�rung der grunds�tzlichen Funktionsweise Erkl�rung des Modulationspiezos

4. Einf�hrung: Entwicklung und Motivation Erstmals entwickelt von Hansma et al. 1989 Vorteil: Zerst�rungfreie Untersuchung von empfindlichen Oberfl�chen (z.B. lebenden Zellen); keine Pr�paration notwendig Nachteil: relativ geringe Aufl�sung 4 28.08.2012 M�glichkeit empfindliche Oberfl�chen wie z.B. lebende Zellen oder Membrane zu untersuchen, ohne diese zu zerst�ren Da keine Pr�paration der Proben ben�tigt wird k�nnen Zellen in physiologischer Umgebung untersucht werden und auch die Reaktion der Zelle auf einen �u�eren Reiz beobachtet werden Nachteil gegen�ber anderen Messtechniken ist die (bisher) relativ geringe Aufl�sung M�glichkeit empfindliche Oberfl�chen wie z.B. lebende Zellen oder Membrane zu untersuchen, ohne diese zu zerst�ren Da keine Pr�paration der Proben ben�tigt wird k�nnen Zellen in physiologischer Umgebung untersucht werden und auch die Reaktion der Zelle auf einen �u�eren Reiz beobachtet werden Nachteil gegen�ber anderen Messtechniken ist die (bisher) relativ geringe Aufl�sung

5. Einf�hrung: Nanopipetten Aufl�sung im Bereich des Spitzen-durchmessers Borsilikatglaspipetten mit einem �ffnungsdurchmesser < 100 nm Quarzglaskapillare mit �ffnungsdurchmessern � 10 nm 5 28.08.2012 Zur verbesserten Aufl�sung ben�tigt man Pipetten mit einer m�glichst kleinen �ffnung Pipetten werden mit Hilfe eines sog. �Pullers� gezogen Quarzglaskapillare mit �ffnungsinnendurchmesser � 10 nm sind verf�gbar aber schwer zu handhabenZur verbesserten Aufl�sung ben�tigt man Pipetten mit einer m�glichst kleinen �ffnung Pipetten werden mit Hilfe eines sog. �Pullers� gezogen Quarzglaskapillare mit �ffnungsinnendurchmesser � 10 nm sind verf�gbar aber schwer zu handhaben

6. Theorie: Elektrodenstrom 6 28.08.2012 - Als Elektroden werden meist Silber/Silberchlorid-Elektroden verwendet aufgrund der gezeigten Vorteile- Als Elektroden werden meist Silber/Silberchlorid-Elektroden verwendet aufgrund der gezeigten Vorteile

7. Theorie: Funktionsweise 7 28.08.2012 - Es wird gezeigt wie der Ionenstrom gehindert wird, wenn sich die Pipette an eine Oberfl�che ann�hert- Es wird gezeigt wie der Ionenstrom gehindert wird, wenn sich die Pipette an eine Oberfl�che ann�hert

8. Theorie: Abstandsabh�ngigkeit 8 28.08.2012 Auftragung der Stromst�rke gegen den Pipetten-Proben-Abstand (Vergleich theoretische Kurve mit experimentellen Daten) dort wo die Steigung der Kurve gro� ist, ist die Empfindlichkeit der Messung am gr��ten, es besteht jedoch die Gefahr eines �Crashs� es wird daher stets auf den �control point� geregelt Auftragung der Stromst�rke gegen den Pipetten-Proben-Abstand (Vergleich theoretische Kurve mit experimentellen Daten) dort wo die Steigung der Kurve gro� ist, ist die Empfindlichkeit der Messung am gr��ten, es besteht jedoch die Gefahr eines �Crashs� es wird daher stets auf den �control point� geregelt

9. Theorie: Berechnung des Stroms Beschreibung der Widerst�nde, die den Ionenstrom beeinflussen (der Widerstand des Elektrolyten au�erhalb der Pipette wird vernachl�ssigt) Schematisches Bild und Gleichung f�r den Fall eines gro�en Pipetten-Proben-Abstands Schematisches Bild und Gleichung f�r den Fall eines kleinen Pipetten-Proben-Abstands (Abstandsabh�ngigkeit des Ionenstroms) Beschreibung der Widerst�nde, die den Ionenstrom beeinflussen (der Widerstand des Elektrolyten au�erhalb der Pipette wird vernachl�ssigt) Schematisches Bild und Gleichung f�r den Fall eines gro�en Pipetten-Proben-Abstands Schematisches Bild und Gleichung f�r den Fall eines kleinen Pipetten-Proben-Abstands (Abstandsabh�ngigkeit des Ionenstroms)

10. Betriebsmodi: Constant-Height-Modus 10 28.08.2012 Beim Constant-Height-Modus bleiben die Pipette und die Probe auf einer H�he Signalst�rke liefert topographische Daten Vorteile und Nachteile Beim Constant-Height-Modus bleiben die Pipette und die Probe auf einer H�he Signalst�rke liefert topographische Daten Vorteile und Nachteile

11. Betriebsmodi: Constant-Current-Modus 11 28.08.2012 Beim Constant-Current-Modus (vergleichbar mit Constant-Force-Modus bei AFM, etc.) wird Pipetten-Proben-Abstand konstant gehalten topographische Daten erh�lt man direkt aus der Bewegung des z-Piezos Vorteile und Nachteile Beim Constant-Current-Modus (vergleichbar mit Constant-Force-Modus bei AFM, etc.) wird Pipetten-Proben-Abstand konstant gehalten topographische Daten erh�lt man direkt aus der Bewegung des z-Piezos Vorteile und Nachteile

12. Betriebsmodi: z-Modulationsmodus 12 28.08.2012 - Spitzen-Proben-Abstand wird nicht konstant gehalten, sondern sinusf�rmig moduliert - Modulationsamplitude wird konstant gehalten (� 50 nm) - Sollwert der Ionenstromamplitude wird festgelegt und dar�ber der Spitzen-Proben-Abstand geregelt - Topographische Informationen aus Amplitude des Ionenstroms, gemessen mit Hilfe eines Lock-in-Verst�rkers - Vorteile und Nachteile - Spitzen-Proben-Abstand wird nicht konstant gehalten, sondern sinusf�rmig moduliert - Modulationsamplitude wird konstant gehalten (� 50 nm) - Sollwert der Ionenstromamplitude wird festgelegt und dar�ber der Spitzen-Proben-Abstand geregelt - Topographische Informationen aus Amplitude des Ionenstroms, gemessen mit Hilfe eines Lock-in-Verst�rkers - Vorteile und Nachteile

13. Anwendungen: Zellh�he 13 28.08.2012 Man n�hert sich zun�chst dem Boden an auf dem die Probe aufgetragen ist und setzt willk�rlich einen Ionenstrom (kleiner als der S�ttigungsstrom) fest Scannt man nun die Probe n�hert man sich jeweils bis zum gesetzten Sollwert des Ionenstroms und erh�lt somit die H�he der Probe an diesem Ort Man n�hert sich zun�chst dem Boden an auf dem die Probe aufgetragen ist und setzt willk�rlich einen Ionenstrom (kleiner als der S�ttigungsstrom) fest Scannt man nun die Probe n�hert man sich jeweils bis zum gesetzten Sollwert des Ionenstroms und erh�lt somit die H�he der Probe an diesem Ort

14. Anwendungen: Bestimmung desZellvolumens 14 28.08.2012 Die Probe wird in viele Quadrate unterteilt (umso mehr umso exakter die Messung) Die H�he jedes einzelnen Quadrats wird bestimmt Mit der H�heninformation erh�lt man Quader und deren Summe ergibt das Volumen der Probe Die Probe wird in viele Quadrate unterteilt (umso mehr umso exakter die Messung) Die H�he jedes einzelnen Quadrats wird bestimmt Mit der H�heninformation erh�lt man Quader und deren Summe ergibt das Volumen der Probe

15. Anwendungen: Dynamischer Prozess 15 28.08.2012 - Da die Messung per SICM zerst�rungsfrei und relativ schnell ist (ein Scan dauert wenige Minuten) k�nnen Prozesse lebender Zellen wie Wachstum oder Osmose beobachtet werden- Da die Messung per SICM zerst�rungsfrei und relativ schnell ist (ein Scan dauert wenige Minuten) k�nnen Prozesse lebender Zellen wie Wachstum oder Osmose beobachtet werden

16. Ausblick: Kombination SICM und SNOM 16 28.08.2012 Links konventionelle optische Mikroskopie: Schirm befindet sich weit vom Doppeltspalt entfernt (Abstand >> ?); nur 0tes Beugungsmaxima zu sehen, da b << ?; keine Aufl�sung < ? m�glich/ keine Information �ber den Spalt Rechts Nahfeldmikroskopie: ein Einzelspalt wird nahe (einige nm) vor dem Doppeltspalt entlang bewegt (dieser entspricht in der SNOM einer Nahfeldsonde); dabei gilt w << ?; man beobachtet die Intensit�t auf dem weiter entfernten Schirm und erh�lt somit eine Aussage �ber b (Aufl�sung ist also < ?) Anmerkung: da w << ? muss das Licht durch w tunneln weshalb die Intensit�t des Signals sehr klein wird Links konventionelle optische Mikroskopie: Schirm befindet sich weit vom Doppeltspalt entfernt (Abstand >> ?); nur 0tes Beugungsmaxima zu sehen, da b << ?; keine Aufl�sung < ? m�glich/ keine Information �ber den Spalt Rechts Nahfeldmikroskopie: ein Einzelspalt wird nahe (einige nm) vor dem Doppeltspalt entlang bewegt (dieser entspricht in der SNOM einer Nahfeldsonde); dabei gilt w << ?; man beobachtet die Intensit�t auf dem weiter entfernten Schirm und erh�lt somit eine Aussage �ber b (Aufl�sung ist also < ?) Anmerkung: da w << ? muss das Licht durch w tunneln weshalb die Intensit�t des Signals sehr klein wird

17. Ausblick: Kombination SICM und SNOM 17 28.08.2012 Mit Hilfe von SICM zur Abstandskontrolle konnte die Aufl�sung von SNOM-Messungen verbessert werden Verkleinert man die �ffnung der Nanopipette sollte die Aufl�sung weiter verbessert werden k�nnen Mit Hilfe von SICM zur Abstandskontrolle konnte die Aufl�sung von SNOM-Messungen verbessert werden Verkleinert man die �ffnung der Nanopipette sollte die Aufl�sung weiter verbessert werden k�nnen

18. Ausblick Weitere Kombination mit anderen Messtechniken Verbesserung der Aufl�sung durch die Verwendung von kleineren �ffnungs-durchmessern der Pipetten Beobachtung der Geschwindigkeit und des Ausma�es von Wirkstoffen z.B. in der Krebsforschung 18 28.08.2012

19. Zusammenfassung Abh�ngigkeit (bei kleinen Abst�nden) des Ionenstroms vom Spitzen-Proben-Abstand wird ausgenutzt Abbildung von lebenden Zellen in physiologischer Umgebung (keine vorherige Pr�paration notwendig) Zerst�rungsfreie Abbildung von sensiblen Oberfl�chen wie z.B. Membranen Dynamische Prozesse k�nnen untersucht werden Kombination mit anderen Messtechniken f�hrt zur Verbesserung dieser oder der SICM und zur simultanen Untersuchung mit zwei Messtechniken 19 28.08.2012

20. Vielen Dank f�r Ihre Aufmerksamkeit 20 28.08.2012

21. Literaturverzeichnis P. K. Hansma, B. Drake, O. Marti, S. A. C. Gould, C. B. Prater, Science, 1988, 243, 641 Y. E. Korchev, J. Gorelik, M. J. Lab, E. V. Sviderskaya, C. L. Johnston, C. R. Coombes, I. Vodyanoy, C. R. W. Edwards; Biophys. J., 2000, 78, 451 A.Janshoff ,Grundlagen und Anwendung der Rastersondenmikroskopie�, Johannes Gutenberg Universit�t Mainz A. I. Shevchuk, Y. E. Korchev� Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 2212 �2216 J. Rheinl�nder and T. E. Sch�ffer,Journal of Applied Physics, 105, 094905 2009 21 28.08.2012

22. Literaturverzeichnis 6) M. B�cker, Dissertation, Friedrich-Alexander-Universit�t Erlangen-N�rnberg, 2009 Y. E. Korchev, C. L. Bashford, M. Milovanovic, I. Vodyanoy, M. J. Lab, Scanning Ion Conductance Microscopy of Living Cells, 73, 1997, 653-658 S. A. Mann, J. W. Meyer, I . D. Dietzel, Integration of a scanning ion conductance microscope into phase contrast optics and its application to the quantification of morphological parameters of selected cells, 224, 2006, 152-157 A. Donnermeyer, Inauguraldissertation, Universit�t Bielefeld, 2007 28.08.2012 22