ESTUDIO DEL GANGLIO CENTINELA EN EL MELANOMA CUTANEO

1. ESTUDIO DEL GANGLIO CENTINELA EN EL MELANOMA CUTANEO M.J. LOPEZ POVEDA I. VIDAL-ABARCA GUTIERREZ D. LOPEZ MOTOS E. MARTINEZ BARBA HU VIRGEN DE LA ARRIXACA 11 de NOVIEMBRE de 2011 MURCIA

2. Importancia de los factores pronósticos en la estadificación del melanoma (M) • El comportamiento biológico del M está determinado por la interacción de factores que marcarán el pronóstico y el manejo terapéutico. • Elevado interés en conocer e identificar dichos factores pronósticos independientes. • No existe ningún marcador molecular, cromosómico, inmunohistoquímico o histopatológico en el tumor primario que pueda predecir de forma precisa cómo va a comportarse el tumor.

3. 6ª clasificación de la American Joint Committee on Cancer (AJCC): el pronóstico dependerá principalmente de: • Espesor del tumor primario (Indice de Breslow) • Presencia o ausencia de metástasis en los ganglios linfáticos regionales

4. Procedimiento diagnóstico más preciso para determinar el estado histológico de los ganglios linfáticos regionales El estado patológico del ganglio centinela (GC) se convirtió en el factor pronóstico independiente más importante en términos de supervivencia global (SG). Estandarización de criterios y resultados.

5. Evolución clínica variable • Otros factores pronósticos: • Edad o sexo • Regresión • Fase de crecimiento vertical • Expresión de ciertos genes • Otros en vías de investigación: • «microarrays» en el tumor primario • estudio molecular

6. Historia y evolución de la técnica del GC de melanoma • Virchow, siglo XIX: “un determinado área del cuerpo drena de forma directa hacia un ganglio linfático antes de pasar a otros ganglios”. • Braithwaite, en 1923: acuñó por primera vez el término de «centinela» a estos ganglios. • Gould y Cabanas, en 1960: aplicación en el campo de la oncología quirúrgica en el ca. de parótida y pene, respectivamente (sin linfografía). • Morton et al. del John Wayne Cancer Institute en 1992, reconoció el uso potencial de la BGC en cirugía oncológica.

7. Morton et al. demostraron la viabilidad del mapeo linfáticoidentificación intraoperatoria del GC usando exclusivamente la tinta azul como marcador: • GC:ganglio más cercano al lugar del M primario de la piel del que recibía drenaje linfático directo. • Demostraron que el GC era el ganglio que albergaba las metástasis con mayor probabilidad y que la exéresis y el estudio intraoperatorio del GC permitía identificar correctamente estas metástasis Selección de pacientes para linfadenectomía completa.

8. Equipo multidisciplinar con experiencia (dermatólogo/ oncólogo, cirujano, radiólogo de medicina nuclear y patólogo). Pasos de la técnica : • SELECCIÓN DE LOS PACIENTES • MAPEO LINFÁTICO PREQUIRÚRGICO • DETECCIÓN INTRAOPERATORIA • EXÉRESIS DEL GC • EXAMEN MICROSCÓPICO • EN OCASIONES, MOLECULAR DEL GC • LINFADENECTOMÍA RADICAL PRECOZ EN AQUELLOS PACIENTES CON GANGLIO POSITIVO

9. SELECCIÓN DE LOS PACIENTES • MAPEO LINFÁTICO PREQUIRÚRGICO • DETECCIÓN INTRAOPERATORIA • EXÉRESIS DEL GC • EXAMEN MICROSCÓPICO • EN OCASIONES, MOLECULAR DEL GC • LINFADENECTOMÍA RADICAL PRECOZ EN AQUELLOS PACIENTES CON GANGLIO POSITIVO

10. Criterios de selección para BGC • Optimizar los resultados. • En general, la BGC debería recomendarse para todo paciente con M primario sin evidencia de metástasis regionales ni a distancia en el que el riesgo de metástasis ganglionares estimado fuera del 10 % o superior (estadios clínicos IB y II [A,B,C] de la sexta clasificación de la AJCC).

11. Criterios en constante revisión debido (estadificación del melanoma es un proceso en evolución). • El riesgo de positividad del GC se correlaciona con : • el espesor del tumor 1º (índice de Breslow y el nivel de Clark) • la presencia o ausencia de ulceración. • AJCC: M primario localizado con un grosor micrométrico de Breslow superior a 1 mm, o aquellos casos que, de forma independiente de cual sea su grosor, presentan un nivel de Clark IV-V y/o ulceración. Algunos autores defienden su uso en lesiones melanocíticas de comportamiento incierto (tumores de Spitz atípicos).

12. SELECCIÓN DE LOS PACIENTES • MAPEO LINFÁTICO PREQUIRÚRGICO • DETECCIÓN INTRAOPERATORIA • EXÉRESIS DEL GC • EXAMEN MICROSCÓPICO • EN OCASIONES, MOLECULAR DEL GC • LINFADENECTOMÍA RADICAL PRECOZ EN AQUELLOS PACIENTES CON GANGLIO POSITIVO

13. Estudio histológico del GC • La introducción de la BGC proporcionó un método perfecto para un diagnóstico rápido y preciso del estado AP del territorio ganglionar. • Las recomendaciones actuales para el análisis histopatológico del GC distan bastante de ser rápidas y fácilmente estandarizables. • Es imprescindible disponer de un método muy sensible y específico.

14. Estudio histológico del GCDificultades en la interpretación del GC • Tendencia a metastatizar en pequeños grupos o incluso en células individuales, difíciles de identificar con H & E. • El estudio debe ser diseñado para detectar la mayoría de estas metástasis (micrometástasis). • El estudio histológico rutinario con algunos cortes teñidos con hematoxilina eosina (H&E) examina menos del 1% del material (↑ falsos negativos). • La sensibilidad aumenta si el estudio con H&E incluye múltiples cortes seriados y tinciones inmunohistoquímicas (al menos, S-100).

15. Estudio histológico del GCDificultades en la interpretación del GC • El detectar todas las MTS implicaría el corte seriado de todo el ganglio centinela dando como resultado miles de secciones por GL. • De su resultado dependerá el pronóstico y la actitud terapéutica posterior, incluyendo la linfadenectomía regional y el posible tratamiento adyuvante. • El estudio histológico completo de todo el ganglio es imposible por la gran carga de trabajo y la eficiencia que se requierecada grupo de estudio ha desarrollado su propio protocolo. METODO EN EVOLUCION.

17. Estudio intraoperatorio del GC • Congelación: morfología subóptima de la bx. • Puede carecer de la región subcapsular del GL (zona más probable de micrometástasis). • La posterior inclusión en parafina, y nuevos cortes de los GL pérdida de muestra. • Sensibilidad de detección de MTS de un 47%. • La mayoría de los autores, consideran como ”gold standard” el procesamiento de rutina con fijación en formol e inclusión en parafina y descartar estudio en congelación. • Alternativa: citologías e improntas requiere gran experiencia. Poco empleada.

18. Procedimiento del GC en AP Disección • Desacuerdo en la exhaustividad del estudio AP: • Cochran, 1988: Un solo corte a través del plano central (técnica bivalva).  realizar no más de 10 cortes seriados cada 2-4 micras de cada cara central de un ganglio seccionado por su mitad longitudinal. • Starz et al, 2001: Cortes en paralelo al azar en ''pan de molde‘.  realizar cortes alternos, cortando el ganglio cada 1-2 mm, y estudiar un número variable de secciones (entre 3 y 20) de cada corte.

19. Procedimiento del GC en AP Disección • M. D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas : “Breadloafing'‘: examen de gran área subcapsular. Se estudia un corte de H & E. Si el resultado es positivo que se informa. Si el resultado es negativo se obtiene una nueva sección H&E (unas 200 micras más profundo) y 2 sin teñir para emplear IHQ. Figure 1. Main grossing techniques: bisection and ‘‘breadloafing.’’ At, the sentinel lymph node protocol calls for breadloafing and inclusion of as many fragments as possible within a single paraffin block

20. HUVA • FIJACION: formol. • INCLUSION: secciones de 2 mms. • CORTES: cada 250 micras, desde 0 a 2000 micras (0, 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 micras). • TINCION BASICA: de cada nivel, 2 H&E. • TINCION IHQ: de cada nivel, 1 s-100, 1 Melan-A, 1 HMB-45. PROTOCOLO DE ESTUDIO HISTOLOGICO DEL GANGLIO CENTINELA DE MELANOMA EN HUVA

22. Características microscópicas • El 20% de los pacientes con melanoma cutáneo presentan GC positivo. • Gran variedad de patrones: epitelioide o fusiforme, pigmentado o amelanótico. • Por lo general, similares a las células de la lesión primaria. • LOCALIZACION: • En general, se encuentran en el seno subcapsular, como células individuales, pequeños o grandes nidos, grupos expansivos. • Con menor frecuencia, intraparenquimatosas. • Rara vez en la cápsula fibrosa. • Extensión extracapsular (5% de los casos).

23. Procedimiento del GC en APTinciones • La tinción con hematoxilina-eosina (HE) convencional permite la detección de una célula de M entre 104-105 células. • Con tinción inmunohistoquímica (IHQ) se consigue detectar una célula de M entre 105-106células. • Se recomienda usar tinciones adicionales de IHQ en las secciones contiguas a la analizada con HE, si no se observan células metastásicas tras el estudio con HE. • Además, la IHQ puede ayudar a detectar pequeños depósitos metastásicos y diferenciar entre células de melanoma y otras células benignas presentes en el ganglio (p.e. nevus).

24. Inmunohistoquímica

25. El empleo sistemático de la inmunohistoquímica como técnica complementaria en el estudio del GC con H-E incrementa de forma notable la detección de células tumorales, por lo que se recomienda su utilización. • PROBLEMAS • Muy laborioso • Elevado coste

26. Procedimiento del GC en APInmunohistoquimica • Del 20% de los casos con GC positivo, un 16% se detectan en la fase inicial de H-E y un 4% IHQ. • Anticuerpo de la proteína S100 citoplasmática (anti-S100 policlonal). Muy sensible pero poco específico. Tb tiñe cels. dendríticas. • Se recomienda completar el estudio con inmunomarcadores más específicos de célula melanocítica: HMB45 (HMB45 monoclonal) y MELAN-A. • Cocktails de anticuerpos melanocíticos («panmelanomas», permiten la detección de HMB45, MART1 y tirosinasa, entre otros, en una sola reacción).

28. MICROMETASTASIS: 812µm H&E S-100 Melan-A HMB-45

29. MACROMETASTASIS: 2.359 µm H&E S-100 Melan-A HMB-45

30. MACROMETASTASIS: 6.458 µm H&E S-100 Melan-A HMB-45

31. CELULAS AISLADAS

32. Nuestros resultados (1998-2011) • Nº Total de GC estudiados:.………..465 • POSITIVOS:………………………78…(16,77%) • MACROMETASTASIS (>2mms):… 40…….(8,60%) • MICROMETASTASIS (0,2-2mms):..28…….(6,02%) • CELULAS AISLADAS (<0,2mms):..10…….(2,15%)

33. Diagnóstico diferencial ante la sospechade células de melanoma en el GC • Células dendríticas paracorticales, macrófagos, células de Schwann de los nervios intraganglionares y paraganglionares o células ganglionares todas ellas S-100 positivas. • Presencia de pigmento (tatuaje o antracita), sobre todo en estudio macroscópico (gránulos mayores y más gruesos en macrófagos). • Presencia de células melanocíticas benignas (no-melanoma) en los ganglios linfáticos: NEVUS INTRAGANGLIONARES. Entre el 1 y el 30 % de los pacientes con M presentan nevus en alguno de sus ganglios.

34. NEVUS VS MELANOMA: • Teoría: el estimulo del melanoma hace que migren. • Nevus S100+ y negativos para HMB45. (¡Cuidado, no todos los M son HMB45+!). • Distinción basada en la localización y la citología: • Localizados en cápsula fibrosa, y ocasionalmente en las trabéculas fibrosas. • Ocasional extensión al parénquima • CIUDADO con la presencia de metástasis linfáticas vasculares en los vasos intracapsulares del ganglio (simulan un nevus capsular) • CITOLOGIA: cls. nevoides con núcleos pequeños y densos y escaso citoplasma. • En raras ocasiones, acúmulos grandes que parecen invadir los GL adyacentes. Citología blanda. Empleo de IHQ (HMB45, MIB1 y p16).

35. NEVUS MELANOMA

36. Significado pronóstico de la presencia de células aisladas de melanoma en el GC • Evolución desigual de los pacientes con GC+  puede que no todas las metástasis en el GC tengan implicación pronóstica. • No existe acuerdo sobre el tamaño mínimo o carga metastásica mínima en el GC con significado pronóstico. • AJCC, sólo hace distinción entre: • MACROMETASTASIS (ganglio metastásico clínicamente palpable o con invasión extracapsular) • MICROMETASTASIS (observadas tras el estudio histológico) • NUMERO DE GANGLIOS AFECTOS (mayor o menor de 3)

37. La afectación del GC por melanoma abarca una amplio espectro que va desde células aisladas a unasustitución completa del ganglio. • Pacientes con MTS en GC presentan disminución de la supervivencia de un 40-50% a los 5 años. • Tanto el nº de GL con MTS como el grado de afectación del ganglio centinela tienen influencia en el pronóstico. • Es frecuente el hallazgo de células aisladas detectadas sólo por IHQ (3-10%, según IHQ empleada), de dudoso significado px.

38. Pacientes con melanoma e IPC en GC muestran SLR y SG similar a los pacientes con GC negativo. • El hallazgo de IPC en GC carece de importancia pronóstica en melanoma. • Pacientes con micrometástasis(acúmulos de al menos tres células) presentaron una SLR y SG significativamente peor (media seguimiento 38,1 meses).

39. SOLO LOS PACIENTES CON MACROMETASTASIS TENIAN UNA SUPERVIVENCIA SIGNIFICATIVAMENTE PEOR QUE EL RESTO • - IPC PODRÍAN CARECER DE SIGNIFICADO PRONÓSTICO

40. PACIENTES CON SUBMICROMETASTASIS PRESENTAN RECURRENCIAS MAS PRECOZMENTE QUE PACIENTES CON GC NEGATIVO

41. ¿Por qué las IPC de melanoma no causan recaídas tras el seguimiento? • JERARQUÍA DE LAS CÉLULAS TUMORALES. • Los melanomas se componen de: • pocas células madre tumorales tumorogénicas (metástasis) • muchas células tumorales más diferenciadas (no metástasis) • Se cree que la mayor parte de las células de melanoma son no tumorogénicas • MacroMTS: clon tumorogénico diseminado • IPC: clon no tumorogénico que no empeora la supervivencia

42. Limitaciones de la BGC: falsos positivos y negativos del estudio histopatológico y molecular • FALSOS POSITIVOS: • Sobre todo al estudio molecular, más que al anatomopatológico, debido a: • contaminación de la muestra durante la bx • contaminación en el laboratorio (menos frecuente) • presencia de células no neoplásicas en el interior del ganglio que también expresen los marcadores utilizados • SOLUCION: metodología cuidadosa

43. Limitaciones de la BGC: falsos positivos y negativos del estudio histopatológico y molecular • FALSOS NEGATIVOS: Aquellos casos con recidiva ganglionar en el mismo territorio estudiado con la BGC, tanto si es el único lugar de recidiva como si es de forma simultánea con otros lugares10%.

44. Falsos negativos debidos a: • Defectos técnicos • Defectos biológicos • Defectos anatomopatológicos

45. Defectos del estudio anatomopatológico • Cuando ha pasado desapercibida una micrometástasis en el examen histológico de un ganglio correctamente identificado como GC. • Muestreo insuficiente del ganglio. • SOLUCION: El muestreo adecuado y técnicas de IHQ aumentan la sensibilidad.

46. SELECCIÓN DE LOS PACIENTES • MAPEO LINFÁTICO PREQUIRÚRGICO • DETECCIÓN INTRAOPERATORIA • EXÉRESIS DEL GC • EXAMEN MICROSCÓPICO • EN OCASIONES, E. MOLECULAR DEL GC • LINFADENECTOMÍA RADICAL PRECOZ EN AQUELLOS PACIENTES CON GANGLIO POSITIVO

47. Finalidad de la biopsia del ganglio centinela • DIAGNOSTICA • PRONOSTICA • TERAPEUTICA

48. CONCLUSION - La evaluación del ganglio linfático centinela es, un procedimiento generalizado que se ha convertido en el método diagnóstico más preciso para determinar el estado histológico de los ganglios linfáticos regionales siendo el factor pronóstico independiente más importante en términos de supervivencia global en pacientes con M. - Es conveniente protocolizar su estudio para realizar un diagnóstico preciso que nos permita, además, la comparación de resultados.

49. Gracias por vuestra atención