La ségrégation des allèles

1. La ségrégation des allèles Pierre Ray Département de Génétique

2. Plan • Rappels : le cycle cellulaire, la méiose, le chromosome • Dominance et récessivité • Ségrégation allelique • Liaison génétique

3. G1 G0 Mort cellulaire Rappel : le cycle cellulaire (1) Préparation à la mitose Cellule quiescente Phase de synthèse de l’ADN Phases G1-G2 = INTERPHASE activité fonctionnelle de la cellule.

4. Fin de Phase S 2 fibres d’ADN Chromatine à l’interphase1 fibre d’ADN Quantité d’ADN G2 G2 4c 1 Chromosome Métaphasique S G0 G1 G1 2c 1ere Div Décondensation INTERPHASE c 2ème Div Chromosome anaphasique MITOSE MITOSE MEIOSE Rappel : l’ADN pendant le cycle cellulaire

5. 2 1 3 6 5 Fin de phase S 4c ADN, 2n chromosomes à 2 chromatides Phase G1 Chromatine à l’interphase 2c ADN, 2n chromosomes Anaphase Métaphase : Formation du fuseau bipolaire 4c, 2n à 2 chromatides Prophase : condensation des Filaments en chromatides 4c, 2n à 2 chromatides Prophase : Recombinaison des chromosomes homologues 4c, 2n à 2 chromatides 4 2’ 2’ 2’ 2’’ 2’’ 2’’ 1’’ 1’’ 1’’ 1’ 1’ 1’ Rappel la méiose : 1ere division cellulaire

6. 7 8 2 cellules filles à 2c ADN n chromosomes à 2 chromatides Métaphase II Anaphase II Séparation des chromatines homologues 4 gamètes 1c ADN n chromosomes À 1 chromatide 9 10 Rappel la méiose : 2eme division cellulaire

7. Caryotype “brut” normal 46, X,Y G-Banding (Giemsa) sur noyau en prophase/métaphase Après traitement par la Cochicine : interagie avec les microtubules du fuseau = bloque la division cellulaire.

8. génome diploïde gamètes haploïdes 46,XX 46,XY 23,X 23,Y Méiose : conclusion • Succession de 2 divisions cellulaires formant à partir d’une cellule diploïde (2n chromosomes) quatre cellules haploïdes (n chromosomes). • Des recombinaisons ont lieu entre les chromatides non-sœur des chromosomes homologues lors de la 1ere division de Méïose. • Du fait de ces recombinaisons tous les gamètes sont différents

9. Chromatides soeurs Centromère Télomère Caryotype “final” normal 46, X,Y Les chromosomes sont identifiés et appariés grace à la carte cytogénétique.

10. Locus et allèles • Allèle : une des formes que peut prendre une même séquence, à un locus donné. • Individu diploïde comporte pour chaque locus 2 allèles (1 mat, 1 pat) • identiques :homozygote • différents : hétérozygote Locus : site physique où se situe une séquence d’ADN (codante ou non) sur un chromosome Chromosomes Homologues Locus A Chromosome Maternel Chromosome Paternel Mat. Allele Pat. Allele Allèle sauvage : le plus fréquent/non pathologique.

11. Ségrégation allélique • Ségrégation allélique • séparation des allèles dans les cellules filles • repose sur la disjonction des paires de chromosomes lors de la méïose • probabilité de transmission d’un gène maternel ou paternel est de 1/2

12. Les lois de transmission des caractères chez le pois par Grégor Mendel • Les 3 premières lois de l'hérédité • dans la 1ère génération d'un croisement impliquant 2 lignées pures différant par un unique caractère, tous les individus présentent un même phénotype. Le caractère qui se manifeste dans la génération F1 est qualifié de dominant et le caractère qui en est exclus est qualifié de récessif • dans la descendance d'un croisement impliquant 2 individus F1 (génération F2), les 2 caractères parentaux réapparaissent suivant une proportion prédictible de 3:1 • si l'on croise des lignées pures différant pour plusieurs caractères, chacun de ces caractères se comporte de façon indépendante vis-à-vis de l'autre

13. Dominance : l’allèle dominant A manifeste toujours son caractère • Récessivité • Allèle récessif ane se manifeste pas en présence de A, ne s’exprime qu’à l’état homozygote Dominance – Récessivité. Expression phénotypique des différents allèles • Génotype : constitution allélique des gènes d’un individu (à un locus donné). • Phénotype : manifestation visible du génotype. Plus généralement c’est l’ensemble des caractères observables d’un individu, dépend du génotype en interaction avec le milieu. • Co-dominance : Aa exprime à la fois le génotype AA et aa (ex : Groupes sanguins A et B) • Semi-dominance : phénotype Aa est intermédiaire entre AA et de aa

14. Individu AA : gamètes A PA = 1 Individu aa : gamètes a Pa = 1 Individu Aa : gamètes A ou a PA = 1/2 Pa = 1/2 Tableaux des gamètes : AA x aa : [A] x [a] Aa x aa : [A] x [a] Phénotype : 100%[A] Phénotype : 50%[A] AA x Aa : [A] x [A] Aa x Aa : [A] x [A] : Phénotype : 100%[A] - Phénotype : 75%[A] Ségrégation d’un couple d’allèles

15. b B b B B b a a a A A A B a A b B a A b A a b B a A B b Ségrégation de deux couples d’allèles : Aa , bB (1)

16. a A a A b b B B B a A b B a A b a A a A b B B b A a b B a A 25% A, b 25% a, b 25% A, B 25% a,B B b Ségrégation de deux couples d’allèles : Aa , bB (2) Fin 1ere division Gamètes

17. Tableaux des gamètes : AABB x aabb : Phénotype : 100%[AB] Ségrégation de deux couples d’allèles Individu AABB : gamètes AB p(AB) = 1 Individu aabb : gamètes ab p(ab) = 1

18. 9 Génotypes : AABB, AABb, AaBb, Aabb, AaBB, aaBB, aaBb, AaBb, aabb 4 Phénotypes : 2 parentaux : p[AB] = 9/16, p[ab] = 1/16 2 recombinés : p[Ab] = 3/16, p[aB] = 3/16 Ségrégation de deux couples d’allèles • Individu AaBb, phénotype [AB] • 4 types de gamètes : AB ou Ab ou aB ou ab. pAB = pab = pAb = paB = 1/4 Tableaux des gamètes : AaBb x AaBb

19. Loi de ségrégation indépendante des caractères • pendant la méïose, la ségrégation d’une paire d’allèles est indépendante de la ségrégation d’une autre paire d’allèles • Pour 1 couple d’allèles 2 types de gamètes 3 génotypes • Pour 2 couples d’allèles 22 = 4 types de gamètes 32 = 9 génotypes • Pour 3 couples d’allèles 23 = 8 types de gamètes 33 = 27 génotypes • Pourn couples d’allèles 2n types de gamètes 3n génotypes • loi vérifiée que dans le cas de couples d’allèles indépendants (situés sur des chromosomes différents)

20. Liaison génétique • Coségrégation de 2 ou plusieurs allèles au cours de la méïose en raison de la proximité physique de leur locus sur le génome

21. Recombinaison (I) • Echange réciproque de matériel génétique entre les chromatides de chromosomes homologues survenant lors de la méïose au niveau des chiasmas • Mécanisme responsable des recombinaisons génétiques

22. Recombinaison(II)

23. Recombinaison (III) • Recombinaisons génétiques • aléatoires et imprévisibles • loi statistique : la probabilité de recombinaison entre 2 locus dépend de la distance physique qui les sépare. • en moyenne 60 chiasmas par génome diploïde pendant la méïose • points chauds de recombinaison • variation du nombre de crossing over en fonction du sexe (femme > homme) • Taux de recombinaison  entre deux locus • pourcentage de gamètes recombinés parmi l’ensemble des gamètes transmis par les parents. •  = nombre de gamètes recombinés / nombre de gamètes transmis • indépendance des 2 locus :  = 1/2 • liaison des 2 locus : 0  < 1/2

24. Allèles non liés = 50% gamètes parentaux Ap Bp Am Bm Ap Bp méïose 25% 25% = 50% gamètes recombinés Ap Bm Am Bp Am Bm Allèles liés > 50% gamètes parentaux Ap Bp Am Bm Ap Bp méïose < 50% gamètes recombinés Ap Bm Am Bp Am Bm Recombinaison (IV) 25% 25%

25. Thomas Hunt Morgan • Morgan découvre un certain nombre de mutations. Il étudie leur transmission d’une génération à l’autre. • Il découvre 4 groupes de liaison: les mutations ne se répartissent pas au hasard dans les descendants. • Il émet l'hypothèse que ces quatre groupes de liaison sont assimilables aux 4 paires de chromosomes de la drosophile. La liaison étant donc "simplement le résultat mécanique de la localisation des gènes dans les chromosomes” • Morgan présente avec Alfred Sturtevant en 1913 la première carte génétique. Depuis on a défini le centiMorgan (cM) comme unité de recombinaison: 1 cM étant égal à 1% de crossing-over.

26. 2 1 L R 2 1 2 1 1 2 x 2 1 R v w L v w R L L w Gamète muté Gamète sauvage 2 1 F1= [ LR] v R 2 1 v w Gamètes F1 Les expériences de Morgan, indépendance des caractères (1) On croise deux lignées pures de drosophiles : Type sauvage : ailes longues [L] et yeux rouges [R] Double mutant : aux ailes vestigiales [v]et sans yeux [w] La descendance (F1) est constituée uniquement d’individus aux ailes longues et aux yeux rouges. Les males de (F1) X femelles (vv,ww) donnent 4 phénotypes dans les mêmes proportions

27. Les expériences de Morgan, indépendance des caractères (3) Tableau des gamètes : Phènotypes attendus : 0.25: 0.25: 0.25: 0.25

28. 1 2 497 [LR] v w R L 1 1 L R 1 2 502 [ Lw] v w w L 1 2 1 1 L w x v w 1 2 Gamète muté 1 1 510 [vR] v R v w R v 1 1 v w 1 2 498 [vw] v w w v Gamètes F1 Les expériences de Morgan, indépendance des caractères (2) On croise les males de (F1) avec femelles (vv,ww) Confirmation de la loi de ségrégation indépendante des caractères avec 0.25: 0.25: 0.25: 0.25

29. 2 L R 2 2 v 2 2 L v x L b R b R 2 v Gamète muté Gamète sauvage b F1= [ LR] Gamètes des F1 males Les expériences de Morgan, association des caractères (1) On croise : lignée sauvage (LL, RR), Double mutant : ailes vestigiales (vv)et aux yeux bruns (bb). La descendance (F1) est constituée uniquement d’individus [L,R] Les males de (F1) X femelles (vv,ww) donnent les 2 phénotypes sauvages dans les mêmes proportions.

30. 2 2 v L 50% [ LR] 2 b R L R 2 x v b 2 v Gamètes muté 2 2 b v v 50% [vb] b b Gamètes des F1 males Les expériences de Morgan, association des caractères (2) On croise alors des males (F1) avec des femelles (vv,bb). On obtient : 996 [L,R], 1008 [v,b]. Pas de recombinaison au cours de cette méiose

31. 2 L R 2 v b 2 2 x v 2 2 L v L b 2 R b L R Gamète muté Gamète sauvage b F1= [ LR] 2 v R Gamètes des F1 femelles Les expériences de Morgan, association des caractères (3) On croise (LL, RR), et (vv,bb). F1 est constituée uniquement d’individus [L,R] On croise alors des femelles de (F1) avec des males (vv,bb). On obtient : 716 [LR], 702 [vb], 296 [Lb], 238 [vR].

32. 2 2 v L 2 [ LR] L R b 716 R 2 v 2 2 v b v 2 [vw] x v b b 702 b 2 L Gamète muté b 2 2 v L [Lb] 2 b v b 296 R 2 2 Gamètes des F1 males v v [vR] R b 238 Les expériences de Morgan, association des caractères (3) On observe des recombinaison lors de la méiose femelle Nb total de méioses : 1952 Nombre de gamètes recombinés : 534 Fraction des gamètes recombinés : 534/1952= 0.27%. Distance entre les 2 loci = 27 cM

33. Morgan Conclusions • Morgan a confirmé les lois de ségrégation des caractères de Mendel. • Démontré l’indépendance de certain caractères et l’association d’autres et confirmé la notion de chromosomes. • Défini la notion de recombinaison et conclu qu’elle était fonction de la distance entre les gènes positionnés sur un même chromosome et a pu établir une carte génétique de la drosophile. • A observé que les recombinaisons chez la drosophile avaient lieu uniquement lors de la méiose des femelles. Ailes vestigiales Yeux bruns Sans Yeux w

34. Cartographie du génome : Cartes génétiques • Ordonnancement de marqueurs polymorphes grâce à l’analyse statistique de leur ségrégation (transmission) au cours des générations • Observation empirique : analyses familiale et statistique • possibilité de distinguer les 2 allèles • disposer d’un nombre suffisant de méïoses pour permettre à l’analyse statistique d’être significative • Cartes établies à partir de la fréquence des recombinaisons méïotiques • Distance exprimée en centiMorgan • 1 cM correspond à une fréquence de recombinaison de 1 % entre 2 marqueurs (1 crossing over pour 100 méïoses = 99% gamètes parentaux, 1% recombinés) • Carte génétique de la femme est environ 40 % plus grande que celle de l’homme (nombre de recombinaisons supérieur)

35. Distance physique (Millon pb) Carte cytogénétique Marqueurs polymorphes Gènes Cartographie du génome : Cartes physique • Ordonnancement de fragments clonés chevauchants reconstituant la molécule d’ADN de départ • Distances mesurées entre les différents marqueurs sont en paires de bases et sont dites absolues • En moyenne 1 cM = 106 pb • Même ordre des marqueurs pour la carte génétique et la carte physique, seules les distances relatives changent • La distance génétique est une approximation de la distance réelle physique

36. De nombreux marqueurs génétiques sont présents tout au long du génome. - Minisatellites : nombre variable de répétitions de séquences courtes (14-100 nt) - Microsatellites : nombre variable de répétitions de nucléotides répétés (2, 3 ou 4). - SNPs : Single nucléotide polymorphisms : substitutions d’un nucléotide. Les différent type de polymorphismes

37. Electropherogram Fluorescence 20 Size (bp) 100 Laser sensor Amplified product Primers Identification des allèles par PCR fluorescente Les allèles des marqueurs microsatellites se distinguent après amplification du locus par PCR et migration éléctrophorètique (séparation des fragments amplifiés en fonction de leur taille).

38. Individu homozygote pour le marqueur étudié. CA, n=5 Allèle Paternel CA, n=5 Allèle Maternel Individu hétérozygote pour le marqueur étudié. CA, n=8 Allèle Paternel CA, n=5 Allèle Maternel Amplification d’un marqueur microsatellite

39. Chr 7 Locus Gene Markers Alleles Chr. Pat. Alleles Chr. Mat. Localisation Chromosomique 7p22 2 8 2 2 3 8 7p11 3 2 D7S3112 4 4 4 2 7q31.2 CFTR M N 7 3 D7S655 7 3 7q32 Haplotype Morbide Haplotype normal Marqueurs, locus et haplotype Un haplotype est la constition allèlique d’un individu pour plusieurs loci contigus, normalement hérités en block par l’un des parent.

40. D7S3112 D7S3112 2 3 2 3 2 3 7 8 7 5 5 4 D7S655 D7S655 D7S3112 D7S655 ∆ ∆ Exemple d’une étude familiale de ségrégation M M

41. M N M N D7S3112 2 4 D7S3112 5 3 N M M N 8 D7S655 3 2 7 D7S655 Mat. Pat. 4 8 3 2 5 7 4 8 2 3 3 2 2 3 5 7 D7S3112 2 5 M M 3 7 D7S655 MN NN MM Example d’une étude familiale de ségrégation (2)

42. Etude de liaison au locus RYR 1 I:1 I:2 I:1 I:2 D19S220 2 1 2 3 D1S3766 3 2 1 3 D19S421 1 2 1 2 D1S3767 2 1 1 2 RYR1 MHS5 D19S422 3 2 1 3 D1S3768 2 1 1 3 D1S3769 3 2 1 3 II:1 II:2 II:1 II:2 D1S3766 3 1 2 3 D19S220 2 2 2 2 D1S3767 2 1 1 2 D19S421 1 1 1 1 MHS5 RYR1 D1S3768 2 1 1 3 D19S422 3 1 3 1 D1S3769 3 1 2 3 RYR 1 est candidat Application : Etude familiale de ségrégation, identification du gène morbide • Exemple : L'hyperthermie maligne, 6 gènes identifiés, dont MHS5 et RYR 1. Etude de liaison au locus MHS5 Exclusion du gène MHS5

43. Conclusion • L’étude de la ségrégation des allèles par analyse de marqueur polymorphe est un outil puissant qui peut être utilisé en recherche, pour la cartographie du génome ou en diagnostic génétique. • Les paradigmes établis au début du siècle (et avant) constituent toujours la base de la génétique moderne.