Přednáška 3 Měření optické aktivity 3.1 Úvod (ukázky spekter)

1. Přednáška 3 • Měření optické aktivity 3.1 Úvod (ukázky spekter) 3.2 Metodika měření cirkulárního dichroismu 2.3 Vibrační cirkulární dichroismus Cirkulární dichroismus (CD) ~ rotační síla přechodu • Rot. síla přechodu je imaginární část skalárního součinu transitních dipólových momentů • udává souvislost struktury molekuly, dané transitním elektrickým a magnetickým dipólovým momentem, a pozorovatelné veličiny – signálu CD: pozorovatelná veličina - CD struktura CH M 2013 přednáška 3

2. Měření optické aktivity 3.1 Úvod Hlavně spektra cirkulárního dichroismu (ostatní jako FDCD, ROA, ve zvláštních kapitolách) CH M 2013 přednáška 3

3. Typické spektrum ECD elektronové přechody • absorpční spektrum obou enantiomerů totožné • CD opačných enantiomerů se liší znaménkem • větší spektrální rozlišení díky tomu, že CD má znaménko Lukáš Palivec, 2003-05 CH M 2013 přednáška 3

4. Typické spektrum VCD - VCD je více lokální fenomén, principiálně každá vazba v molekule je chromofor - VCD poskytuje velmi detailní informace, jěště zesíleno v ROA disymetrický faktor g= De/e Lukáš Palivec, 2003-05 CH M 2013 přednáška 3

5. (1R)-(+)-pinen a-pinen – standard VCD (1S)-(-)-pinen Vladimír Setnička, 1999-2002

6. reálný vzorek – prekurzor léčiva kombinace experimentu a ab initio výpočtu Bouř, Setnička, Navrátilová, …2003 CH M 2013 přednáška 3

7. kombinace experimentu a ab initio výpočtu ECD (time dependent density function theory TDDFT), vyžadují počítat vlnové funkce všech excitovaných elektronových stavů, které přispívají do ECD CH M 2013 přednáška 3

8. 3.2 Metodika měření cirkulárního dichroismu Rysy společné ECD a VCD CD = AL – AR, nelze měřit postupně nejdřív ALpak AR a odečíst, proč? Koncept postupného měření signálu pro LCP a RCP se uplatňuje při měření Ramanovy optické aktivity (ROA) připraví se střídavě LCP a RCP s vysokou frekvencí (typicky 50 nebo 37 kHz) a rozdíl response na LCP a RCP se měří ve fázově citlivém zesilovači (lock-in amplifier), takže vlastně zjišťujeme „synchronně“ responzi na LCP a RCP normalizace na transmisi (jinak při ECD a jinak při VCD) PEM (photoelasticmodulator) – v kombinaci s lineárním polarizátorem - vznik střídavého LCP a RCP aplikací střídavého napětí se vyvolá střídavé mechanické napětí, periodické zpoždění dvou kolmých komponent mezi +l/4 a -l/4 a tedy střídavě LCP a RCP PEM pracuje při stavu své přirozené mechnické resonance, pracujeme bez podstatného uvolňování tepla Ondřej Julínek, 2006

9. Modulace intenzity Vznik chiroptického signálu a funkce PEMu Modulace stavu polarizace PEM • Z materiálu, který propouští (v IR CaF2, ZnSe) • Aplikuje se tlak (vyvolaný piezoelektrickým elementem) • Dvojlomnost (birefrengence) • Indukuje se dráhový rozdíl v intervalu +l/4, -l/4 • Střídavě LCP a RCP • Princip synchronního měření obou responsí je společný pro: - ECD i VCD,pro disperzní i FT spektrometry, pro komerční i laboratorní spektrometry • V PEM dochází k modulaci stavu polarizace, nikoli intenzity • po průchodu opticky aktivním vzorkem se polarizační modulace změní na intenzitní modulaci - střídavý signál AC(alternating current) • response na nepolarizované záření se bere jako stejnosměrný signál DC (direct current) • CD~AC/DC – dociluje se jinak v ECD, dispersním VCD a jinak v FT VCD

10. Vznik signálu dichroismu a funkce PEMu faktor se získá kalibrací CH M 2013 přednáška 3

11. Rysy společné ECD a VCD Spektrální oblasti použitelné pro CD měření jsou obvykle užší než v mateřských spektroskopiích, větší nároky na : - propustnost materiálů, - mechanické vlastnosti,užší spektrální citlivost chlazených rychlých polovodičových detektorů absorpce nesmí být velká ani malá: příliš velká – nedostatek světla dopadajícího na detektor, příliš malá – relativně velký šum, optimální A = 0,6-0,8 Jevy, na které je CD citlivá: - dvojlom, - doprovodné nechtěné polarizace při odrazech, k nim dochází všude – na optických prvcích na oknech kyvet apod. Tyto jevy spektrálně citlivé a způsobují falešné signály pozorované jako artifakty Stálý požadavek ověřování reality CD signálů Formulace a dodržování měřícího protokolu Celé série měření provádět za stejných podmínek (rozbitá kyveta – zkreslení výsledků)

12. 2.3 Elektronový cirkulární dichroismus ve viditelném oboru lze sledovat jen molekuly obsahující chromofory (barevné látky), nebo pak v UV oboru (UV chromofory) rozšířená technika využívaná • v biochemii • vůbec nejčastější aplikace ECD je sledování sekundární struktury proteinů, a různých časových jevů folding a unfolding Pozn.intrinsic (vlastní) chiralita – často slabá optická aktivita (CD), „topologická“ chiralita - chiralita z prostorového uspořádání chirálních či achirálních jednotek, je často doprovázena výraznější optickou aktivitou • DNA, telomery • interakce polypeptidů a DNA s ligandy • indukované CD (ICD) • „malé“ chirální molekuly • nanotechnologiích (topologická chiralita) • studium samoskladných systémů • chirálních ropoznávání Historické poznámky:

13. Schéma optické a elektronické části ECD spektrometru Xenonová lampa dvojitý hranolový monochromátor se současnou polarizační funkcí polarizace vyladěna soustavou křemenných destiček („Filter“) systém štěrbin PEM: napětí vložené na PEM je optimalizováno tak, aby vznikala čtvrtvlnná destička pro všechna l (neděje se tak ve VCD) detektor je fotonásobič (photomultiplier, PM, photomultiplier tube, PMT) elektronika – zpětná vazba „feedback“ zajišťující konstantní DC signál (neděje se tak ve FT VCD) zvyšování napětí na PM – úměrné absorbanci vzorku, měří se „absorpční spektrum“ lze měřit jen do určitého napětí na PM

14. Spektrometr ECD 165 -1100 nm, nejčastěji 180 - 700 nm disperzní spektrometry (scanning) obdobné jednopaprskovým absorpčním spektrofotometrům hranol, proč: • lineární disperzi ve vlnových délkách • optimalizované na velkou světelnou propustnost (throughput) • využívá se polarizace odrazem • disperzní funkce kombinovaná s polarizací (Brewsterův úhel) CH M 2013 přednáška 3

15. Praktické poznámky • Požadavky na vzorek • homogenní: kapaliny, pravé roztoky, kontrola centrigugací • pevné látky: amorfní lze, vždy ale kontrola, zda se neměří arifakry (velký japonský projekt měření ECD pevných látek – řešitelka Kuroda) • nejdřív zjistit jednopaprskovou absorpci (podstatná je absorpce vzorek + rozpouštědlo), je-li A>2 => změna kombinace koncentrace, tloušťka kyvety, rozpouštědlo • Významná absorpce rozpouštědla (pufru) – neužitečné spotřebování světla (obr. tabule) • Pozn. Je poloviční tloušťka kyvety a dvojnásobná koncentrace vzorku z hlediska měření výhodná? • Kyvety • materiál kyvet s malým dvojlomem, izotropní • konvenční křemenné pravoúhlé (Hellma), materiál QS (QX) Quartz, tansmission >80% pro l > 200 nm • vhodné pro teplotní záv. • Veškeré světlo musí procházet vzorkem, žádné reflexe na stěnách, kapalinovém menisku apod., pozor na „zúžené“ kyvety, nutno použit clonu a testovat • jednorázové plastové kyvety se neosvědčují • skládané kyvety 5-500 mm

16. Praktické poznámky • Vlastní měření • měření v atmosféře N2, průtok volit podle oblasti měření podle manuálu, přítomný kyslík aborbuje a mění se průchodem UV záření na ozon – nezdravý a ničí zrcadla • rychlý „scan“ pro určení parametrů měření • měří se současně napětí na fotonásobiči, které je úměrné absorpci • měří se v oblasti absorpce a jejím okolí ( asi 20 nm) • Parametry měření: Časová konstanta (time constant) t (= doba, kdy přístroj „průměruje“ data rychlost záznamu (scan speed) s, šířka pásů (bandwidth) b Mělo by být: t . s <= b/2 S/N ~ (t . n . I0)1/2 CH M 2013 přednáška 3

17. Praktické poznámky • Korekce na nulovou linii • nulová linie, tzv. „baselina“ se získá jako ECD rozpouštědla ve stejné kyvetě, naprosto stejné podmínky jako pro měření vzorku, vždy měřit nulovou linii • V případě malých signálu se může stát, že CD není nulové vně absorpčních pásů, mělo by být alespoň rovné, jinak je něco špatně • Měřit CD „kus“ před a za absorpčním pásem (20 nm), v oblasti bez absorpce by mělo být CD nulové, nebo aspoň rovné • Fluktuace baseliny: krátkodobé (ms – min) a dlouhodobé (min – h), lépe více akumulací, měřit „čerstvé“ nulové linie • Vyhlazování • NEDOPORUČUJE SE, je možné použít jen po dlouhodobé zkušenosti, ověřování, zdali se informace nezkresluje, ve speciálních případech • Údržba • nutno proplachovat kvalitním dusíkem, pak věšinou stabilné • výměna lampy (asi 800 h), vhodné zaznamenávat průběh H.T. na fotonásobiči při specifických parametrech (např. 200-300 nm, 2 nm bandpass). Uchovávat stejný záznam pro novou lampu, též důležité pro posouzení stavu zrcadel) • výměna zrcadel po několika letech CH M 2013 přednáška 3

18. Praktické poznámky • Standardy ACS and CSA, well defined band at around 290.5 nm and opposite intensity band at 192 nm. ACS is easier to handle since less deliquescent and it’s the standard supplied with Jasco instruments: a 0.06% aqueous solution (60mg in 100ml) of d-10-camphorsulfonate in a 10mm cell should give a signal of +190.4 mdeg ([Θ]290.5 = +7910) (1S)-(+)-10-camphorsulfonic acid (CSA) FW 232.30 [α]D 20 +19.9° c2, H2O [Θ]291 = +7820 available from Aldrich C210-7 or from Sigma C-1395 (1R)-(-)-10-camphorsulfonic acid (CSA) FW 232.30 [α]D 20 -21° c2, H2O [Θ]291 = -7820 Aldrich 28,214-6 (1R)-(-)-10-canphorsulfonic acid, ammonium salt (ACS) FW 249.33 [α]D 22 -18.4° c=5.3, H2O [Θ]290.5 = -7910 Aldrich 18,836-0 (1S)-(+)-10-camporsulfonic acid, ammonium salt (ACS) FW 249.33 [α]D 25 +20.9° c=6, H2O [Θ]290.5 = +7910 available from Katayama Chemical, it can be ordered directly from Jasco

19. Praktické poznámky • Rozpouštědla a pufry Table 1: Solvent Transparency Compound Wavelength (nm) for OD= 1.0 1.0-mm Path Length 0.05-mm Path Length H2O 182 176 MeOH 195.5 184 F6iPrOH 174.5 163 F3EtOH 179.5 170 EtOH 195 186 MeCN 185 175 Dioxane 231 202.5 Cyclohexane 180 175 α-Pentane 172 168 CH M 2013 přednáška 3

20. Table 2: Absorbance of Various Salt and Buffer Substances in the Far-UV Region Compound pH No Absorbance Absorbance of a 10 mM solution in Abovea 1.0 mm Cuvette at: 210 nm 200 nm 190 nm 180 nm NaClO4 170 nm 0 0 0 0 NaF, KF 170 nm 0 0 0 0 Boric Acid 180 nm 0 0 0 0 NaCl 205 nm 0 0.02 >0.5 >0.5 Na2HPO4 210 nm 0 0.05 0.3 >0.5 NaH2PO4 195 nm 0 0 0.01 0.15 Na Acetate 220 nm 0.03 0.17 >0.5 >0.5 Glycine 220 nm 0.03 0.1 >0.5 >0.5 Diethylamine 240 nm 0.4 >0.5 >0.5 >0.5 NaOH pH 12 230 nm >0.5 >2 >2 >2 Boric Acid, NaOH pH 9.1 200 nm 0 0 0.09 0.3 CH M 2013 přednáška 3

21. Table 2: Absorbance of Various Salt and Buffer Substances in the Far-UV Region Compound pH No Absorbance Absorbance of a 10 mM solution in a 1.0 mm Cuvette at: Above 210 nm 200 nm 190 nm 180 nm Tricine pH 8.5 230 nm 0.22 0.44 >0.5 >0.5 TRIS pH 8.0 220 nm 0.02 0.13 0.24 >0.5 HEPES pH 7.5 230 nm 0.37 0.5 >0.5 >0.5 PIPES pH 7.0 230 nm 0.2 0.49 0.29 >0.5 MOPS pH 7.0 230 nm 0.1 0.34 0.28 >0.5 MES pH 6.0 230 nm 0.07 0.29 0.29 >0.5 Cacodylate pH 6.0 210 nm 0.01 0.20 0.22 CH M 2013 přednáška 3

22. 2.4 Vibrační cirkulární dichroismus CH M 2013 přednáška 3